论文部分内容阅读
高密度脂蛋白很早以前就被证明能够中和内毒素的毒性。载脂蛋白A-I是高密度脂蛋白中主要的蛋白成分,因此其在中和内毒素毒性方面上发挥了至关重要的作用。根据载脂蛋白A-I的两个天然突变体的突变位点及Edmunson轮,我们课题组利用PET表达系统已经成功构建出包括天然突变体ApoA-Imilano在内的七个半胱氨酸突变体,分别为A-I（S52C）、A-I（N74C）、A-I（K107C）、A-I（G129C）、A-IM（R173C）、A-I（K195C）、A-I（S228C）。实验证明,这些突变体无论是在二级结构还是体外功能上都不尽相同,这就增加了突变后会影响其体内功能的可能性。实验目的:本研究对野生型apoA-I和分别发生在apoA-I多肽链7个α螺旋片段上的半胱氨酸突变体结合脂质后生成的八种重组高密度脂蛋白（rHDLwt,rHDL52,rHDL74,rHDL107,rHDL129,rHDL173,rHDL195和rHDL228）的抗炎性能做了比较,以观察这些特定的半胱氨酸突变体的结构和功能之间是否存在某些必然的联系。我们希望这些问题的解答能够对我们更深入、更全面的认识高密度脂蛋白抗炎保护特性的机制有所帮助。实验方法:利用pET原核表达系统对野生型及突变的apoA-I进行蛋白质表达,Ni2+亲和柱进行目的蛋白纯化,获得多肽链C-末端带有6个组氨酸标签（6×His tag）的高纯度蛋白（纯度＞90%）,再经过去内毒素处理,最后利用胆酸盐透析方法做成重组的高密度脂蛋白用于下面的体内功能实验。我们利用尾静脉注射脂多糖来诱导小鼠内毒素血症模型的生成,并以其肛温升高0.5度作为标准,然后再注射重组的高密度脂蛋白。同时为了更加准确的评估这几种重组高密度脂蛋白的抗炎性能,我们选择了两个时间点加以分析,以注射脂多糖为计时点,检测其注射后3h和24h的重组高密度脂蛋白的治疗效果,主要通过ELISA试剂盒检测血清中的促炎症因子的水平,并对注射LPS 24h后的小鼠的肺组织做了常规的病理切片分析。为了进一步探索高密度脂蛋白的抗炎机制,我们分析了利用野生型aDoA-I及其半胱氨酸突变体结合脂质后形成的重组高密度脂蛋白的成份,即:脂质与apoA-I或其半胱氨酸突变体的比率。实验结果:内毒素血症小鼠模型的构建:BALB/c小鼠尾静脉注射LPS后,大约11.5min,即可检测到其肛温升高0.5℃,从而可以判定内毒素血症小鼠模型构建成功。血清中炎症因子的检测:LPS注射后24h的结果:LPS注射24h后,经ELISA试剂盒检测,结果显示:与野生型A-I构建的重组高密度脂蛋白rHDLwt相比,rHDL74和rHDL52更能显著降低小鼠血清中TNF-α的水平,而且,经过rHDL74治疗后,其TNF-α的水平已经降低到正常水平。与此相反的是,经rHDL195及rHDL228处理的小鼠,其TNF-α水平与只注射LPS的对照组相比不但没有降低,反而升高。另外经过rHDLwt处理的小鼠,其TNF-α水平与LPS对照组相比,也明显的降低。同时,结果也显示,rHDLwt及其它半胱氨酸突变体构成的重组高密度脂蛋白（rHDL228除外）能显著降低LPS诱导产生的IL-1β水平,而且,与rHDLwt相比,rHDL74和rHDL52更能有效的降低IL-1β水平。除此之外,结果还显示,rHDL74能显著降低IL-6的水平,相反,rHDL52及rHDL107却能导致IL-6水平的升高。LPS注射3h的结果:与LPS注射24h结果相似,与只注射LPS的对照组相比,rHDL74、rHDL52以及rHDLwt治疗后的小鼠有较低的TNF-α水平,但其它重组高密度脂蛋白治疗后的小鼠没有明显的变化。同时,rHDL74、rHDL52以及rHDL107能降低IL-1β的水平,其它重组高密度脂蛋白对于IL-1β的水平没有明显的影响。另外,没有任何一种重组高密度脂蛋白能显著影响IL-6的水平。肺组织常规病理切片H&E染色分析:结果显示,只注射LPS的对照组,其肺组织有明显的病理学变化,包括:1)充血;2)肺间质组织增厚;3)白细胞浸润,包括单核细胞和中性粒细胞。而经过rHDLwt治疗后的小鼠的肺组织切片只显示了较轻的病理学变化,比如:较轻的肺间质组织增厚等等。经rHDL74治疗后的肺组织切片强力支持其具有保护肺组织抵抗LPS诱导的肺损伤,其H&E染色结果非常接近只注射生理盐水的对照组的染色结果,基本上没有明显的病理学变化。然而,rHDL228处理过的小鼠的肺组织切片却显示出相对于只注射LPS的对照组更严重的病理学变化。经其它几种重组高密度脂蛋白处理后,小鼠肺组织的病理学变化都明显比只注射LPS组的小鼠的肺组织要轻一些,显示除了rHDL228外,其它几种高密度脂蛋白都能发挥一定的抗炎作用。重组高密度脂蛋白成分的分析:rHDL74中的DPPC与apoA-I的质量比率要比rHDLwt中的高（1.93±0.06 vs.1.75±0.11）,相反rHDL228是几种重组高密度脂蛋白中比率最低的,与rHDLwt相比,rHDL228:（0.82±0.05 vs.1.75±0.11,P＜0.05）;rHDL107（1.49±0.12 vs.1.75±0.11,P＜0.05）and rHDL129（1.47±0.04 vs.1.75±0.11,P＜0.05）,这三种高密度脂蛋白中的DPPC与apoA-I的比率与rHDLwt相比都有所降低。其它重组高密度脂蛋白未见明显的差异。结论:1.rHDL74及rHDL52比rHDLwt更能有效的降低炎症因子TNF-α和IL-1β的水平。2.rHDL74比rHDLwt更能有效的降低炎症因子IL-6的水平。3.rHDL74及rHDL52能够比rHDLwt更有效的保护肺组织抵抗LPS诱导的损伤。4.rHDL228不但没有任何抗炎作用,相反它还能加剧炎症反应,增加LPS诱导的肺损伤。5.rHDL74中所含有的DPPC要比rHDLwt高,相反,rHDL228中的DPPC是这几种重组高密度脂蛋白中最低的。总之,半胱氨酸突变体不仅对apoA-I的二级结构和体外功能造成了一定的改变,而且还对其体内中和LPS的抗炎功能产生了巨大的影响,基于rHDL74在本实验中的保护作用,它可能会成为临床上极具潜力的治疗内毒素引起的败血症的基因工程药物。