论文部分内容阅读
为了探讨调节Bmovo基因表达对家蚕（Bombyx mori）卵巢发育及丝蛋白合成的影响，本研究首先对Bmovo基因的4种剪接体Bmovo-1(GU477588), Bmovo-2(HQ831344), Bmovo-3(HQ831345)和Bmovo-4(JQ665224)通过qPCR进行表达谱分析，发现ovo基因主要在家蚕生殖腺中转录；Western blot检测结果显示，在卵巢和精巢中均有BmOVO-1和BmOVO-2，而BmOVO-3主要存在于卵巢中，BmOVO-4主要存在于精巢中；组织免疫荧光发现家蚕卵巢滤泡细胞、滋营细胞、卵母细胞中均有BmOVO蛋白表达。为了探讨过表达Bmovo-1基因对家蚕卵巢发育及丝蛋白合成的影响，将Bmovo-1过表达转基因载体pigA3GFP-IeNeo-VlgBmovo-1利用精子介导法导入家蚕卵，通过G418和荧光筛选，结合PCR、斑点杂交鉴定获得了转基因家蚕，qPCR检测结果显示转基因家蚕Bmovo-1基因在卵巢、精巢中的转录水平分别是非转基因家蚕的2.23和1.85倍；生产性状调查结果显示，与非转基因家蚕相比，转基因家蚕雌蛹重下降10.34%，茧层量下降14.59%；雄蛹重下降12.24%，茧层量下降21.72%，而造卵数提高了13.39%。性腺解剖发现，转基因家蚕卵巢重量上升，精巢重量下降。血液和卵巢中海藻糖含量及血液海藻糖酶活性测定发现，转基因家蚕血液和卵巢中海藻糖含量上升，血液中海藻糖酶活性转基因家蚕与非转基因家蚕之间无明显差异。为了从分子水平理解家蚕卵巢发育和卵子发生的机制，取5龄3d、6d及化蛹2d的家蚕卵巢，分别抽提RNA，并纯化mRNA，三组的样品混合后进行RNA-Seq测序。测序完成后得到的总Reads数为6306078，平均长度为100bp，其中clean reads达到98.87%，测序饱和度良好，证明测序数据真实可靠。clean reads对应的基因条数为9609。以Actin3基因为参照，计算所测基因的log2(Fold_change)，将log2(Fold_change)大于2的定义为高表达基因，结果发现有66个基因为高表达基因。KEGG分析发现这些基因主要集中在能量代谢、蛋白合成、信号转导等路径中。研究结果基本解明了卵巢发育、卵子发生与基因表达的关系以及卵巢发育与丝蛋白合成的互作；为提高产丝量或产卵量提供了新的线索和方案。本研究同时还开展了转基因家蚕丝腺分泌表达类胰岛素生长因子（hIGF-I）研究。将转基因载体piggyA3GFP-serHS-IGF-I-ie-neo通过精子介导法导入蚕卵，利用neo、gfp基因双重筛选，经过PCR和点杂交鉴定获得转基因家蚕，并培育至G8代。转基因家蚕蚕茧脱胶，利用等电点沉淀法沉淀出含有hIGF-I的蛋白混合物，ELISA检测结果显示每克蚕茧中hIGF-1的含量达到162.7ng。