脑室周围白质软化(periventricular leukomalacia,PVL)是目前早产儿脑损伤的最主要类型,为早产儿死亡和其后发生脑瘫和认知行为障碍的主要因为。脑室周围白质主要由髓鞘构成细胞-少突胶质细胞(Oligodendrocyte,OL)所构成。OL由前体细胞发育而来,历经OL前体、不成熟OL以及成熟OL几个阶段。研究表明,在胎龄23～32周,OL前体大量出现于脑室周围白质内,对自由基攻击具有明显易损性,因而OL前体被公认为是PVL病变的主要靶细胞,在早产儿PVL的发病机理中起着关键作用。缺血学说和感染学说是目前诠释早产儿PVL发病机理相并列的两大学说,缺氧缺血可导致反应性氧自由基(ROS)生成显著增加,在OL前体对自由基攻击内在易损性基础上,ROS通过脂质过氧化、蛋白氧化和DNA损伤等途径,导致OL前体死亡。感染/炎症诱导小胶质细胞的激活,是感染型PVL发生发展的重要环节。激活的小胶质细胞介导大量活性氧和活性氮的生成,尤其由NO和O2-·反应后所生成的过氧亚硝酸盐(Peroxynitrite,ONOO-),被认为是导致OL前体死亡的主要毒性因子。不论是缺血性因素抑或是感染性因素,其最终的病理改变均为脑室周围白质OL前体的受损和丢失,而缺血或感染/炎症时产生的大量自由基所介导的OL前体损伤,则可能是PVL发生发展的最终共同通路。迄今对PVL防治尚无有效方法。姜黄素是一种从中药姜黄中提取的酚类物质,具有很强的抗氧化和抗炎症反应作用,可减少自由基的生成和促进自由基的清除,还能减少各种炎症介质的合成和分泌,减少组织细胞氧化性和炎症性损伤。研究表明,姜黄素对缺氧缺血或内毒素引起的肝、心、肾、脑等损害有一定的保护作用,但有关其在PVL中的作用及机制研究尚无报导。　　 在国家自然科学基金和上海市教委基金的资助下,本课题首先对少突胶质细胞抗氧化损伤能力的成熟依赖性进行研究,在此基础上,从缺血因素和感染因素的角度,分别从细胞和在体两个层面,探讨缺血因素和感染因素对OL前体的毒性作用,以及姜黄素对毒性作用的体内外阻断效果,藉以阐明姜黄素对OL前体的可能保护作用及其内在机制,为今后对早产儿PVL成功防治探索可行性途经。　　 第一部分少突胶质细胞抗氧化损伤能力的成熟依赖性研究　　 取SD新生大鼠脑组织分别进行体外OL前体和成熟OL培养,探讨OL抗氧化损伤能力的成熟依赖性。显示在相同H2O2浓度刺激下,OL前体的细胞活力明显低于成熟OL。OL前体的抗氧化物质T-SOD、GSH-Px和CAT活力及GSH含量均明显低于成熟OL,氧化物质MDA含量则显著高于成熟OL。OL前体的促凋亡基因产物Bax和Caspase-3的合成量均明显高于成熟OL,抗凋亡基因产物Bcl-2的含量则显著低于成熟OL,OL前体的Bcl-2/Bax比例亦明显低于成熟OL。上述结果提示,OL对自由基攻击存在成熟依赖性,OL前体的抗氧化酶系统发育不完善以及Bcl-2/Bax比例的差异,是导致OL前体对自由基的处理能力低下、对自由基攻击易损的重要因为。　　 第二部份缺血因素对OL前体的毒性作用及姜黄素对毒性作用的体外阻断研究　　 以H2O2损伤OL前体作为氧化应激损伤模型,探讨对OL前体的毒性作用及姜黄素对毒性作用的体外阻断研究。显示对培养OL前体应用100μmol/L H2O2刺激,OL前体的活力降至正常对照组的52.7％；凋亡细胞数明显增高；氧化物质MDA含量显著上升,抗氧化物质SOD、GPx和CAT的活性显著降低,GSH含量明显减少；促凋亡蛋白Bax以及活化型caspase-3、9的显著增加以及抗凋亡蛋白Bcl-2表达显著降低。应用10μg/ml姜黄素则可明显提高OL前体的细胞活力至98.1％；明显抑制H2O2诱导的细胞凋亡；显著增加SOD、GPx和CAT的活性,提升GSH含量以及降低MDA浓度；并明显上调Bcl-2的表达以及抑制H2O2诱导的Bax表达及caspase-3、9的活化增加,提高Bcl-2/Bax的比例。上述结果提示,姜黄素对OL前体氧化损伤的保护作用,与减轻OL前体的脂质过氧化、提高Bcl-2/Bax的比例以及抑制caspases的活化,从而增强OL前体的抗氧化能力、抑制由H2O2诱导的OL前体凋亡。　　 第三部份缺血因素对OL前体的毒性作用及姜黄素对毒性作用的体内阻断研究　　 对2日龄缺血型PVL新生大鼠在PVL前和PVL后即刻应用姜黄素50mg/kg.d,从体内评估姜黄素的脑保护效果。脑病理显示两个用药组的脑白质病变较PVL组明显改善,其中重度白质病变的发生率分别较PVL组降低了62.5％和43.8％,另有12.5％的脑白质完全正常；免疫组化显示用药组脑内的O4和MBP染色的IOD值均较PVL组非常显著地增高；并非常明显地抑制由缺氧缺血引起的SOD、GPx和CAT活性的下降、GSH含量的减少,以及MDA含量的升高:用药组的Bcl-2合成量亦较PVL组明显增加,Bax以及caspases-3、9活化片段的合成量均较PVL组明显减少。上述结果提示,姜黄素对缺氧缺血的脑白质保护作用,与其调节脑内的抗氧化系统、以及调节脑内的凋亡相关蛋白的表达有关,从而可显著减轻缺氧缺血引起的OL的丢失,对PVL新生大鼠脑白质损伤起保护作用。　　 第四部份感染因素对OL前体的毒性作用及姜黄素对毒性作用的体外阻断研究　　 建立小胶质细胞与OL前体共培养模型,探讨LPS对OL前体的毒性作用及姜黄素对毒性作用的体外阻断研究。结果显示LPS对单纯培养的OL前体并无直接毒性,在小胶质细胞与OL前体共存时,LPS诱导小胶质细胞激活,从而介导OL前体凋亡。姜黄素能抑制LPS诱导的OL前体细胞凋亡。LPS刺激使小胶质细胞NO、O2-·的生成量均显著增加,iNOS的基因表达及其产物iNOS的含量均较对照组非常显著升高,NAO亚基胞膜gp91-phox和p67-phox的表达亦较对照组非常明显增加。应用10μg/ml姜黄素,小胶质细胞的NO、O2-·的生成量均明显减少,iNOS基因的mRNA和蛋白表达均较LPS组非常显著降低,NAO亚基胞膜gp91-phox和p67-phox的合成亦较LPS组显著减少。上述结果提示,姜黄素对OL前体的保护作用,主要通过抑制LPS诱导小胶质细胞内iNOS的表达和NAO活化,从而减少其产物NO和O2-·的产生,起到保护OL前体的作用。　　 第五部份感染因素对OL前体的毒性作用及姜黄素对毒性作用的体内阻断研究　　 对2日龄感染型PVL新生大鼠在PVL前和PVL后即刻应用姜黄素50mg/kg.d,从体内评估姜黄素的脑保护效果。脑病理显示两个用药组的脑白质病变较PVL组明显改善,其中重度白质病变的发生率分别较PVL组降低了25％和18.7％,另有31.3％和34.4％的脑白质完全正常；免疫组化显示用药组脑内的O4和MBP染色的IOD值均较PVL组显著增高；IB4免疫荧光标记显示脑内激活的小胶质细胞数明显少于PVL组；脑内NO含量和O2-·的生成能力均明显降低；脑内iNOS的基因表达及其产物iNOS的合成量均较PVL组非常显著减低；脑内NAO亚基胞膜gp91-phox和p67-phox的合成亦较PVL组非常显著减少。上述结果与体外研究结果一致,提示姜黄素对LPS诱导的感染型PVL的脑白质保护作用,主要与抑制了脑内iNOS和NAO的活化,从而减少NO和O2-·的大量生成有关。　　 通过上述缺血或感染因素对少突胶质细胞前体的毒性作用、以及姜黄素对毒性作用的体内体外阻断系列研究,初步阐明了缺氧缺血氧化应激以及LPS诱导小胶质细胞激活导致OL前体死亡的相关机理,初步探讨了姜黄素对OL前体的可能保护作用及其内在机制,尤其证实姜黄素在阻断缺氧缺血、感染/炎症导致OL前体死亡的相当有效性,可望为今后对早产儿PVL的成功防治探索可行性途径,提高早产儿生存率和改善生存质量,提高人类素质。