利用抑制差减杂交技术鉴定野生茄子Solanum torvum Sw.黄萎病抗性相关ESTs

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茄子是我国主要的茄果类蔬菜之一,在我国蔬菜生产中占有重要地位。近年来由于保护地栽培面积和复种指数的不断提高,土传病害对茄子生产造成的危害日趋严重,其中以茄子黄萎病最为普遍和最难防治。茄子黄萎病的防治是一世界性难题,现代研究表明栽培种茄子没有黄萎病抗源,其近缘野生种Solanum torvum高抗黄萎病,因此通过了解其黄萎病抗性的分子机理,获得茄子黄萎病抗性相关基因,分析其功能,对茄子抗病育种具有重要的指导意义。本研究拟通过构建茄子黄萎病抗性的抑制差减文库,分离获得茄子黄萎病抗性相关基因,研究茄子黄萎病抗性形成的分子机理。主要研究结果如下:(1)本试验以茄子近缘野生种Solanum torvum为材料,以受黄萎病菌胁迫的材料为实验组,以无菌水处理的材料为对照,利用抑制差减杂交技术,构建了茄子野生种S. torvum黄萎病抗性相关的正反向差减文库。对正反向文库中的2376克隆进行剔除、筛选,得到了199条差异表达uniqueESTs。通过blastx对比,其中103个ESTs在非冗余蛋白质数据库中找到已知功能的同源蛋白,55个ESTs找到匹配序列但功能未知,41ESTs个未找到相匹配序列;经过GO功能注释,共分为3大类,24小类,分类分析表明,S. torvum受到黄萎病菌侵染后诱导抗性差异基因表达,涉及多个生理途径,抗病基因的表达可能受到一些结合蛋白蛋和转录因子的调控。(2)根据对差减文库中差异表达unique ESTs进行BLAST分析的结果,选取文库中的8个可能与黄萎病抗性有关的差异表达Unique ESTs,利用荧光定量PCR进一步分析这些差异UniqueESTs在不同处理条件下(黄萎病菌处理和无菌水处理)的表达模式。结果表明4条unique ESTs(Z471、Z992、Z778、F25)为上调基因,1条unique ESTs(F1155)为下调基因,其余3条uniqueESTs(Z32、Z882和F1245)在不同的处理条件下,表达情况没有一定的规律性。(3)根据荧光定量PCR的结果,选取上调表达的一条EST(Z471),利用RACE技术在受黄萎病菌胁迫和无菌水处理的Solanum torvum的幼苗根部分别获得了Z471的全长cDNA序列,不同的处理条件下得到的基因全长序列相同,命名为StPTI5基因。该基因的开放阅读框为522bp,编码173个氨基酸,5’端有43bp非编码区,3’端有171bp包括PloyA尾巴在内的非编码区,分子量为19.4349KD,理论等电点PI为7.85;含有一个AP2结构域,与番茄病程相关激活转录因子PTI5同源性为90%。
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