双光子与近红外超氧阴离子荧光探针的设计合成及其应用研究

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荧光成像分析具有操作简单、灵敏度高以及可以实现生物分子和生物过程原位检测等优势,被广泛应用于生命活动过程中生物活性小分子(如H2O2、ONOO-、半胱氨酸、同型半胱氨酸等)、生物大分子(如碱性磷酸酶、硝基还原酶、Amyloid-βPlaques等)、金属离子(如Cu2+、Hg2+、Fe2+等)以及生物微环境(如黏度、极性等)的检测与成像。其中,双光子和近红外荧光成像分析具有近红外激发,背景荧光低、对生物样品光损伤小、组织穿透力强等优点,在细胞、组织和活体成像分析领域具有广阔的应用前景。药物诱导急性肾损伤(AKI)是由药物本身或者其代谢产物引起的肾脏损伤,已成为药物研发失败和药品撤市的最常见原因之一。除此之外,目前常规手段很难实现早期药物诱导急性肾损伤的检测,AKI的早期检测仍面临着挑战。超氧阴离子(O2·-)是一种活性氧物种,相关研究表明其在肾组织中浓度水平的变化与药物诱导急性肾损伤的发生密切相关。因此,发展无创检测超氧阴离子的方法是评估和预测药物诱导急性肾损伤的有效方法。本文报道了两例新型的线粒体靶向双光子或近红外O2·-探针,实现了在细胞、组织和活体水平上高灵敏、高选择地检测O2·-,并成功应用于可视化检测药物诱导急性肾损伤过程中O2·-含量的变化。此外,也首次利用荧光探针阐明左旋肉碱(LC)可以缓解药物引起的肾毒性。具体内容如下:第一,由于生物体中一些生物活性物种与超氧阴离子有着相似的性质,因此高特异性检测超氧阴离子仍然是一个很大的挑战。针对上述问题,我们首先在羟基萘酰亚胺的羟基上修饰各种超氧阴离子识别基团,构建了系列荧光探针,通过荧光分析法详细研究了不同识别基团对超氧阴离子的响应性能(如选择性和稳定性等),筛选出了综合性能最优的超氧阴离子识别基团(三氟甲基磺酸酯)。第二,在上述工作基础上,我们以羟基萘酰亚胺为双光子发色团、三苯基磷阳离子为线粒体靶向基团、三氟甲基磺酸酯为O2·-识别位点构建了一种线粒体靶向的O2·-双光子荧光探针Naph-O2·-。探针本身荧光信号较弱,与O2·-反应后,会形成分子内电荷转移(ICT)效应增强的Naph-OH,使荧光信号显著增强,达到“关-开”型检测O2·-的目的。该探针具有灵敏度高(检测限为0.39μM)、稳定性好以及选择性好等优点,我们将其成功应用于顺铂诱导肾细胞和肾组织损伤模型中超氧阴离子的检测以及细胞水平LC对顺铂诱导急性肾损伤修复的评估。第三,为了在活体中探究药物诱导急性肾损伤过程中超氧阴离子的含量变化,我们进一步发展了具有高选择性和高灵敏的近红外线粒体靶向超氧阴离子荧光探针NIR-O2·-。探针NIR-O2·-表现出比双光子探针Naph-O2·-更高的灵敏度(0.24μM)和更低的背景荧光。通过小鼠活体成像系统对肾脏部位成像表明探针NIR-O2·-能够高灵敏检测到顺铂诱导肾损伤及其修复过程中超氧阴离子的含量变化,并且说明顺铂诱导急性肾损伤与顺铂的剂量、用药时间密切相关,有望为新药开发过程中的肾毒性筛查提供直观有效的新方法。
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