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目的:三黄泻心汤作为经典方剂临床上常用于动脉粥样硬化,上呼吸道感染,糖尿病肾病,胃炎胃溃疡等疾病的治疗,化学成分研究显示其主要含有大黄酸、大黄素、芦荟大黄素、盐酸小檗碱、黄连碱、巴马汀、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素等成分。课题组前期研究炎症通路级联放大效应探索了大黄-黄芩“相使为用”增效的分子机制,建立了LPS诱导小鼠腹膜巨噬细胞Raw264.7炎症模型,以对LPS介导产生NO的抑制作用为评价指标,对黄连5个主要单体成分进行了活性筛选,针对抑制活性最佳的黄连碱对该模型中NF-κB、MAPK以及JAK/STAT炎症信号通路的激活进行了深入研究。然而,研究未涉及三黄泻心汤成分对NLRP3炎症小体通路的影响。Caspase-1作为NLRP3炎症小体的重要组成部分之一,通过体外构建caspase-1抑制剂筛选体系,再对三黄泻心汤主要单体成分进行目的性筛选,可为三黄泻心汤以及单体成分的临床使用提供理论依据。方法:（1）以caspase-1 c DNA为模板,分别以（BamH I-p20,p20-Sal I）、（BamH I-p10,p10-Sal I）以及（BamH I-p20,p10-Sal I）为上下游引物,进行PCR扩增后,使用限制性内切酶Sal I、BamHI分别消化扩增后的产物以及原核表达载体pColdI,采用T4连接酶将目的片段与原核载体连接成重组质粒,转化如宿主细胞并进行复制,利用载体自身具备的抗Amp抗生素基因,筛出重组质粒;（2）将构建好的重组质粒转入表达感受态细胞Trans BL21（DE3）,利用异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）在原核表达系统中诱导外源基因的表达。pCold I载体携带冷应激基因cspA启动子,能够在低温条件下表达,通过抑制其他蛋白质的表达来提高目的蛋白的产量。（3）亲和层析法纯化蛋白:pCold I载体携带6×His标签（His-tag）,该标签能够与二价金属离子,如Ni2+、Co2+等螯合,通过亲和层析的方法对目标蛋白进行纯化。（4）构建caspase-1体外活性筛选体系,对三黄泻心汤主要单体成分小檗碱（Ber）、黄连碱（Cop）、表小檗碱（Epi）、巴马汀（Pal）、药根碱（Jatr）、大黄酸（Rhe）、大黄素（Emo）、芦荟大黄素（Alo）、大黄酚（Chry）、大黄素甲醚（Phy）、黄芩苷（Bae）、黄芩素（Bai）、汉黄芩素（Wogi）以及汉黄芩苷（Woga）进行抑制活性筛选,终浓度50μM;以VX-765（100nM）为阳性对照;（5）Raw264.7细胞接种于6孔板,密度达到80%换无血清培养基,黄连碱（1-30μM）作用2h后,LPS（1μg/mL）继续刺激24h,裂解细胞;SDS-PAGE上样检测,分别使用anti-TLR-4和anti-MyD88一抗检测各组蛋白表达;（6）Raw264.7细胞接种于6孔板中过夜培养,以Cop（1-30μM）、Ber 30μM预处理1h后加入Alexa Fluor 488 conjugated LPS孵育20min。使用4%多聚甲醛固定20min,TLR-4一抗于4℃条件下孵育2h,Alexa Fluor 545 conjugate二抗孵育1h,于激光共聚焦显微镜下观察。（7）THP-1细胞接种于24孔板中,100nM PMA诱导24h贴壁。用不含血清培养基换液,（1-30μM）Cop预处理1h后,分别采用IFN-γ（1000U）以及IFN-γ（1000U）+LPS（1μg/ml）继续刺激24h后,收集培养基上清,用于NO水平的检测。（8）SD大鼠脚底皮下注射角叉菜胶（carrageenan）建立足肿胀模型,使用足趾容积检测仪0-4h内检测黄连碱对carrageenan诱导的大鼠足肿胀以及体表温度升高的影响;收集大鼠肿胀部位皮下组织,冰面上匀浆,离心后得到匀浆液上清,采用Elisa法检测各组大鼠肿胀部位组织中细胞因子NO以及TNF-α的水平。结果:（1）PCR扩增产物通过1%琼脂糖凝胶电泳检测,在1000bp左右能看见明显的特异性条带;p20、p10、p10（D381E）、p20p10以及p20p10（D381E）与pCold I双酶切后,连接酶分别连接过夜并转化进DH5α感受态细胞,挑取5个单克隆进行酶切鉴定以及菌落的PCR鉴定,结合测序结果表明所筛选的菌落为阳性克隆;（2）考马斯亮蓝染色,结果表明IPTG诱导后,p20、p10以及p20p10蛋白大量表达,在25kDa、14.4kDa以及45kD左右有明显条带;（3）亲和层析法纯化以上蛋白后,在包含Ac-WEHD-AMC的体系中不具有剪切活性;将上述蛋白纯化前的裂解液上清加入体系中,结果显示p20p10与p20p10（D381E）裂解液上清具备剪切活性;（4）以上泻心汤单体成分中,Cop、Jatr以及Emodin对caspase-1的活性抑制率大于60%。Cop抑制效果最佳,IC50=31.66±0.22μM;（5）LPS诱导RAW264.7细胞TLR-4以及MyD88蛋白表达升高,（1-30μM）黄连碱对其无明显抑制作用;（6）黄连碱1-30μM对LPS和TLR-4的绑定无明显作用,而小檗碱30μM,与报道相符,可显著抑制该绑定;（7）IFN-γ（1000U）以及IFN-γ（1000U）+LPS（1μg/ml）均可刺激THP-1细胞释放NO,高剂量Cop对其有一定的抑制作用。（8）皮下注射角叉菜胶引起大鼠足肿胀以及肿胀部位体表温度升高,黄连碱3.87mg/kg显著抑制大鼠足肿胀程度,同时显著减少肿胀部位组织匀浆中NO和TNF-α的产量。结论:（1）三黄泻心汤主要单体成分均对caspase-1剪切活性有不同程度的抑制作用,其中黄连碱的抑制作用最强;（2）黄连碱对LPS诱导的Raw264.7细胞TLR-4和MyD88蛋白高表达无明显抑制作用,对TLR-4与LPS绑定无影响;（3）黄连碱抑制IFN-γ以及IFN-γ+LPS诱导的THP-1细胞NO释放;（4）黄连碱对角叉菜胶诱导的大鼠足肿胀有明显改善作用。