碳酸酐酶(CA)是一种含锌金属酶,广泛分布于人体组织器官中,参与体内许多重要的生理活动。包括酸碱平衡、细胞呼吸、骨吸收、房水分泌、糖原异生和脂肪形成等。一旦该酶缺失或其活性发生异常都将导致机体的病变。这使得CA成为多种人类疾病研究中的重要靶点。因此,寻找其抑制剂,并用于疾病治疗具有重要的意义。现在临床应用的碳酸酐酶抑制剂为磺胺类及其衍生物。口服磺胺类碳酸酐酶抑制剂,可能会出现与碳酸酐酶抑制有关的一系列全身反应,如电解质紊乱、代谢性酸中毒、肾脏损伤、造血障碍等,对人体有较大的副作用。限制了磺胺类碳酸酐酶抑制剂在肿瘤、癫痫等疾病治疗方面的应用。因此,从药用真菌发酵液中提取副作用低的碳酸酐酶抑制剂具有重要的意义。本试验首先对碳酸酐酶的测定方法的优化进行了探索。并以碳酸酐酶抑制率为指标,优化药用真菌树舌发酵液液体发酵培养基组成。通过各种分离手段从树舌发酵液中分离抑制剂的活性成分。并研究了树舌发酵液中抑制活性成分对小鼠肝脏糖代谢的调节。1.在前人工作的基础上,通过分光光度法以显色剂稳定性、显色剂与酶反应强度、显色剂自身分解对显色剂酶反应测定结果的影响为指标,对碳酸酐酶的测定方法进行了优化。实验结果显示碳酸酐酶酶活测定的最佳方法为：0.0181g对硝基苯酚乙酯溶于1ml无水乙醇,然后将此溶液与0.156g二乙基丙二酸酯加入pH6.4的0.2mol/L磷酸盐缓冲液中,终体积为100ml。在35℃下水浴反应30min。此方法适用于大量样品的快速测定,以及样品间的酶活比较。2.利用树舌发酵合成碳酸酐酶抑制剂。以发酵液对碳酸酐酶的抑制率为指标,通过单因素试验和四因素三水平L。(34)正交试验得到最佳优化培养基(g/L)：果糖20,硝酸钠2,马铃薯173,硫酸铵1.3。并对发酵工艺进行优化：最佳发酵初始pH5.5,最佳转速160r/min。使用此培养基液体培养树舌菌丝体,其所得发酵液对碳酸酐酶抑制率达到91.43%。显著高于未优化的培养基(69.81%)。3.以碳酸酐酶抑制率为指标,对树舌发酵液进行醇沉后其滤液抑制率为80.3%,而滤渣的抑制率仅为20.78%。对其滤液成分进行化学检识,结果显示其中含有苷类和生物碱类化合物,没有检测出黄酮类化合物以及皂苷类化合物的成分。然后对此滤液用M-Bondapak-C18常压液相色谱柱和Sephadex LH-20常压液相色谱柱进一步分离纯化。将最终得到的洗脱液收集冻干,得到白色粉末。利用HPLC对收集的样品进行纯度检验,结果显示纯度为100%。纯化样品经LC/MS分析,由于正负离子不对应,离子较多,无法判断哪个离子为主要峰。4.通过对糖尿病小鼠肝脏的糖耗量实验,认为碳酸酐酶抑制剂能够通过抑制CA酶活,影响反应体系中产物CO2的释放。从而影响乙酰CoA的生成,进一步导致丙酮酸和乳酸的积累并使糖耗量降低。