研究背景:感染性疾病,尤其是慢性持续性感染疾病,是危害动物和人类健康与生命的全球性顽疾之一。其中许多难治且危害严重的感染(如结核、病毒性肝炎等)均与细胞内微生物感染有关。常见的胞内感染细菌主要有:结核杆菌、伤寒沙门氏菌、嗜肺军团菌、麻风杆菌等。这些胞内感染菌进入人体后,能以不同方式逃避巨噬细胞的杀灭并在细胞内生存、繁殖,还能够逃避体液免疫和抗生素的杀灭作用,使巨噬细胞反而成为庇护所,导致临床治疗困难。抗菌肽(antimicrobial peptides,AMP)是一类具有抗菌活性的多肽,是动物和植物免疫防御系统产生的对抗病原体致病作用的防御性肽类活性物质,在生物体的天然免疫中起着重要的作用。抗菌肽具有广谱、高效的抗菌活性,与其他抗菌药物不易产生交叉耐药性,而且不易诱导耐药菌株的产生。抗菌肽PR39是最初从猪小肠中分离纯化出的一种富含脯氨酸的抗菌肽,是抗菌肽cathelicidin家族中的一员。抗菌肽PR39对细菌(如结核分支杆菌、伤寒沙门氏菌等)具有广谱、高效的抗菌作用。除了抗菌作用以外,PR39还具有中和内毒素、抗炎、免疫诱导、组织修复、抑制凋亡等功能。所以与传统抗生素相比,PR39在细菌感染的治疗中,具有多方面优势,有望成为治疗胞内细菌感染的新一代抗菌药。然而,抗菌肽在临床实际应用中仍面临着很多问题:①天然抗菌肽分离纯化困难,成本较高,患者不易承受。②作为多肽,口服易被消化破坏,只能静脉或肌注给药,应用不便,并可能引起过敏反应。③容易降解,需要持续给药。④同其他普通抗生素一样,抗菌肽不易在细胞内富集,从而难以发挥其对胞内菌的抗菌作用。因此PR39和其他抗菌肽的临床应用,特别是在胞内菌感染治疗中受到了较大限制。而寻找合理、有效、方便而且经济的治疗方式,成为PR39等新型高效抗菌肽应用于胞内菌感染治疗的关键问题。研究目的:构建携带巨噬细胞特异性启动子及抗菌肽PR39基因的重组腺病毒(Ad-SP-PR39),靶向巨噬细胞高效表达抗菌肽PR39基因。从体外细胞水平和体内活体水平检测目的基因在mRNA水平和蛋白水平的表达及基因表达的靶向性,并进一步研究该重组腺病毒在体内外抗胞内菌感染的作用。为抗菌肽PR39在胞内微生物感染基因治疗中的合理安全应用提供理论和实验基础。研究方法:1.采用拼接PCR方法合成抗菌肽PR39基因,经NheI和SalI双酶切后克隆入pIRES2-GFP载体,导入小鼠巨噬细胞株RAW264.7,筛选出稳定表达株。通过荧光显微镜、RT-PCR、免疫细胞化学等方法检测抗菌肽PR39基因在小鼠巨噬细胞中的表达情况。采用平板活菌技术方法,检测携抗菌肽PR39基因的小鼠巨噬细胞RAW264.7在体外杀灭胞内菌、抵抗胞内菌感染的能力。2.抗菌肽PR39多克隆抗体的制备:利用蛋白抗原决定簇预测软件DNASTAR,预测抗菌肽PR39的抗原决定簇序列,用化学合成法合成其抗原决定簇序列。合成的多肽与KLH偶联、纯化后免疫家兔。制备的抗血清经盐析纯化后用SDS-PAGE和ELISA方法进行抗体的纯度和滴度测定。3.抗菌肽PR39原核表达载体的构建及诱导表达:根据Genbank中抗菌肽PR39序列和大肠杆菌对密码子的偏爱性,设计并合成PR39序列的拼接PCR引物,通过拼接PCR扩增合成PR39 DNA序列。克隆到pET-32a(+)、pET28a、pQE30、pET31b等原核表达载体。在以上载体的基础上,进一步构建了一系列PR39基因的串联表达载体。并对构建的载体进行原核诱导表达。4.根据GenBank中巨噬细胞特异性启动子序列,设计并合成其拼接引物,通过PCR方法拼接合成巨噬细胞特异性启动子序列。克隆到真核表达载体pEGFP-N1中,替换其中的CMV启动子,得到重组质粒pSP-GFP。将质粒pSP-GFP和pERFP-N1等摩尔浓度混合,用Lipofectamine2000转染小鼠巨噬细胞株RAW264.7、人结肠癌细胞株Lovo、人肝癌细胞株HepG2、人乳腺癌细胞株ZR-75-30和非洲绿猴肾细胞株COS-7。转染48h后用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的表达并计数。5.构建由巨噬细胞特异性启动子调控的PR39基因穿梭质粒;将腺病毒骨架质粒pAdEasy-1转入大肠杆菌BJ5183,制备AdEasier Cell并鉴定。将穿梭质粒转化感受态AdEasier Cell,通过细菌内同源重组构建重组腺病毒质粒,进行酶切鉴定。将腺病毒质粒转染293细胞,包装出重组腺病毒Ad-SP-PR39,并扩增和纯化。用重组腺病毒感染小鼠巨噬细胞RAW264.7,在转录水平和蛋白水平检测目的基因的表达。并检测Ad-SP-PR39在各种细胞中表达目的基因的靶向性。6.用重组腺病毒Ad-SP-PR39体外感染小鼠巨噬细胞RAW264.7,用平板活菌计数方法检测巨噬细胞表达产物对伤寒杆菌和减毒牛型结核分支杆菌(BCG)的杀菌作用。将重组腺病毒经气管感染C57BL/6小鼠肺部,肺组织冰冻切片,荧光显微镜观察腺病毒在肺部的定位及存活情况;采用RT-PCR和免疫荧光技术检测目的基因的表达及定位情况。C57BL/6小鼠经气管感染BCG,感染细菌后再经气管感染重组腺病毒Ad-SP-PR39,并检测腺病毒的表达产物PR39体内对减毒牛型结核分枝杆菌BCG的杀灭效果。研究结果:1.用拼接PCR成功扩增出抗菌肽PR39基因,并构建了其真核表达载体pIRES2-PR39,体外转染小鼠巨噬细胞RAW264.7后,筛选出了目的基因的稳定表达株。在细胞中检测到目的基因转录水平和蛋白水平的表达。表达抗菌肽PR39的小鼠巨噬细胞RAW264.7的裂解产物具有较强抗菌作用;携抗菌肽PR39的巨噬细胞体外杀灭胞内伤寒杆菌的能力增强。2.成功制备了家兔抗PR39多克隆抗体,抗体经盐析纯化后进行SDS-PAGE,电泳结果显示制备的抗体纯度较高。进一步用ELISA方法测定抗体效价,效价达1:10 000。3.成功构建了抗菌肽PR39基因的多种原核表达载体,反复尝试了目的基因的单独表达、串连表达、与Trx或KSI融合表达、融合后串连表达等多种表达模式,并对诱导表达条件进行多方面优化。但是,由于抗菌肽PR39特殊的抗菌机制和强烈的抗菌活性,导致蛋白产量极低甚至几乎不表达,最终无法得到大量的目的蛋白。4.采用拼接PCR方法成功合成了巨噬细胞特异性的启动子序列,构建了由巨噬细胞特异性启动子调控的绿色荧光蛋白(GFP)真核表达载体pSP-GFP。质粒pSP-GFP和红色荧光蛋白(RFP)真核表达载体pERFP-N1按1:1混合后,转染巨噬细胞和多种非巨噬细胞。GFP和RFP在不同细胞中的表达具有差异,由巨噬细胞特异性启动子调控的GFP基因仅在巨噬细胞中高效表达,而在非巨噬细胞中则几乎没有表达。而以CMV启动子启动的RFP基因则在巨噬细胞和非巨噬细胞中均有相近的高表达。5.构建了携巨噬细胞启动子及PR39基因的穿梭质粒和AdEasier Cell。利用细菌内同源重组原理,成功构建成由巨噬细胞特异性启动子调控的PR39腺病毒表达载体(Ad-SP-PR39)。重组腺病毒经扩增纯化后感染小鼠巨噬细胞,能够有效表达目的基因。Ad-SP-PR39能够靶向巨噬细胞有效表达目的基因。6.重组腺病毒Ad-SP-PR39体外感染小鼠巨噬细胞RAW264.7后,其表达的抗菌肽PR39能增强巨噬细胞对伤寒杆菌和减毒牛型结核分支杆菌(BCG)的杀菌作用。重组腺病毒经气管感染C57BL/6小鼠肺部后,能够有效定位到肺部,并能表达目的基因;采用RT-PCR和免疫荧光技术可以检测目的基因的表达。C57BL/6小鼠经气管感染重组腺病毒Ad-SP-PR39后,PR39基因表达产物能够有效杀灭小鼠肺部的减毒牛型结核分支杆菌BCG。研究结论:1.携抗菌肽PR39基因的小鼠巨噬细胞RAW264.7能有效表达抗菌肽PR39,表达产物能增强巨噬细胞体外杀灭胞内伤寒杆菌的能力。2.成功制备了抗菌肽PR39多克隆抗体。3.由于抗菌肽PR39特殊的抗菌机制和强烈的抗菌活性,目前尚无法通过原核表达的方式得到大量的目的蛋白。4.由巨噬细胞特异性启动子调控的GFP基因能够靶向巨噬细胞高效表达。为抗菌肽PR39基因的靶向性表达提供了实验基础。5.重组腺病毒Ad-SP-PR39能够有效感染小鼠巨噬细胞并表达目的基因,而且目的基因的表达对巨噬细胞具有靶向性。6.重组腺病毒Ad-SP-PR39能增强巨噬细胞体外杀灭伤寒杆菌和体内外杀灭减毒牛型结核分支杆菌的作用。