【摘 要】
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副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,H.parasuis)是存在于猪上呼吸道的条件致病菌,猪感染H.parasuis时发病主要是一系列炎症反应,死亡率高达50%,每年给猪的养殖业造成巨大损
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副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,H.parasuis)是存在于猪上呼吸道的条件致病菌,猪感染H.parasuis时发病主要是一系列炎症反应,死亡率高达50%,每年给猪的养殖业造成巨大损失。外膜囊泡(Outer membrane vesicles,OMVs)能携带多种蛋白质、脂多糖等病原相关分子模式(PAMPs)进入宿主细胞,诱导细胞炎症反应甚至死亡。H.parasuis能分泌OMVs,但其生物学特性及对宿主细胞作用还鲜有研究。本研究以血清5型强毒株H45为研究对象,以密度梯度离心法提纯OMVs,观察其结构及测定其粒径,进行蛋白质组学分析;研究OMVs和H.parasuis对小鼠单核巨噬细胞RAW 264.7的毒力和致炎作用,并研究caspase-11基因对OMVs介导细胞致炎作用的影响;利用同源重组技术构建H45的lpx M基因缺失株,研究该基因缺失对H45生长情况、抗血清杀菌能力、生物被膜形成能力、对细胞毒力作用和部分抗生素敏感性的影响。利用统计学方法对实验结果进行相关性分析,结果如下:1.从H45中提取的OMVs呈球形,粒径分布在60-70 nm之间,平均粒径为63.32nm,含有478种H.parasuis蛋白质,主要来源于细胞质、细胞质膜、周质和外膜,大多数蛋白质与菌株重要生命活动有关,GO功能注释结果显示47.9%蛋白参与生物学过程,29.8%蛋白参与分子功能,22.3%蛋白参与细胞组成,COG功能注释显示蛋白质主要参与翻译、核糖体结构和形成、氨基酸运输和代谢等,表明OMVs在H.parasuis生命活动中发挥重要作用。2.H45及其OMVs对小鼠单核巨噬细胞RAW 264.7具有强烈的毒力作用,引起细胞死亡,激活炎性小体,使细胞分泌出大量的炎症细胞因子IL-1β和IL-18。用OMVs刺激caspase-11表达稳定降低的细胞株,IL-1β和IL-18分泌水平降低,说明caspase-11在OMVs介导的细胞炎症反应中起到重要作用。3.成功构建H45的lpx M基因缺失株,并分析其生物学特性变化,发现缺失株生长速度在8 h前慢于野生株,之后保持一致;生物被膜形成能力下降;抗50%猪血清补体杀菌能力降低;对巨噬细胞毒力作用减弱;对头孢噻吩等11种抗生素感敏性不变,而对阿莫西林克拉维酸和磺胺二甲异噁唑由耐药变成敏感,氨苄西林从中介变成敏感。
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