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阿扎那韦(atazanavir sulfate,品名Reyataz)是一种具备抑制HIV病毒蛋白酶功能的药物,由诺华(Novartis)公司(瑞士)研制。2003年经FDA批准上市。(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-2-丁醇是抗艾滋病药物阿扎那韦等一些列药物的手性合成前体,可由(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-2-丁酮经酮基还原酶催化还原制备。催化过程中氧化还原反应普遍需要NADH、NADPH以及FAD等辅酶来提供还原力,在工业化生产中辅酶会带来较高的成本导致酶催化制备法难以工业化。为解决这一关键性限制因素,本文通过基因工程方法,借助E.coli BL21(DE3)表达酮基还原酶(KRED),并以此菌株的超声破菌液为粗酶液催化还原(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-2-丁酮生成(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-(2R)-丁醇。首先,根据新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium)的短链脱氢酶的基因加以修饰作为目的基因序列,通过基因合成得到KRED的基因片段。将KRED片段重组到pET-28a载体中,得到表达载体pET-28a-kred。然后将质粒转化入E.coli BL21(DE3)中,获得重组菌E.coli BL21-KRED。经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析结果表明在34KD处有明显条带。利用超声破碎仪将菌体在缓冲液中超声破碎制备粗酶液,对酶诱导表达条件进行优化结果显示E.coli BL21-KRED在25℃,220r/min,0.2mmol/L的诱导剂IPTG诱导条件下诱导表达8小时,可得到相同蛋白浓度下酶活最高的粗酶液。通过构建重组表达菌株E.coli BL21-KRED,实现了含有酮基还原酶的粗酶液的发酵。经粗酶液催化,可将(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-2-丁酮催化还原生成(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-(2R)-丁醇。经过反应条件的优化,利用NAD~+作为氢离子传递工具,由异丙醇提供还原力,将底物催化还原为产物,助溶剂甲苯、异丙醇以及粗酶液形成的两相混合反应体系是该反应的特点。结果表明在27℃,pH为10.0的条件下反应时间15小时,(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-(2R)-丁醇的产量达到最高,在投料量≤15时,可以实现完全反应。然后,利用硅藻土吸附实现产物的粗分离,并设计实验优化了硅藻土吸附的时间、温度以及使用硅藻土吸附处理的次数,得出在经过3小时质量为底物两倍的硅藻土在10%底物浓度的反应液中达到饱和,吸附的最佳温度为40℃,硅藻土的最佳处理次数为2次。再使用乙酸乙酯洗脱硅藻土吸附的产物,并设计实验优化了乙酸乙酯的浸泡时间、浸泡处理次数,得出使用反应液2倍体积的乙酸乙酯浸泡质量为底物质量两倍的硅藻土时,最佳的浸泡时间为1小时,浸泡处理的次数为两次。最后,用重结晶的方法纯化乙酸乙酯提取出的产物粗品。本工艺的最终总收率为82~85%。