药源林蛙居群鉴别及遗传多样性和GH基因分析

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中国林蛙和黑龙江林蛙统称为药源林蛙。药源林蛙具有重要经济意义和医疗保健价值。   它们的雌蛙输卵管干制品入药,称哈士蟆油或哈蟆油,也称“田鸡油”,为名贵的动物药材。   近年来,随着经济的发展及人们生活水平的日益提高,人们对食品安全的要求越来越高,生产绿色食物在祖国各地蓬勃发展。对药源林蛙的需要更是供不应求。其中的中国林蛙,产油量较大,利用价值较高。人们为了经济利益对中国林蛙无节制的狩猎,使其野生种群数量急剧减少。因此,对中国林蛙的遗传多样性以及种群遗传结构进行研究,保护好有限的野生中国林蛙资源是一项紧迫的任务。而随着野生中国林蛙的日渐减少,黑龙江林蛙作为替代品,逐渐被人们所开发利用。但是黑龙江林蛙个体较小,产油量低,一直是人们亟待解决的问题。   为了初步了解中国东北地区中国林蛙遗传资源的遗传结构,本研究采集了中国黑龙江及辽宁地区中国林蛙2 个地理居群,通过RAPD 标记,对中国林蛙遗传结构和遗传联系进行了分析,采用尾分析法-RAPD 标记对东北三省三个地区的中国林蛙居群进行了居群鉴别,并在此基础上进行了中国林蛙与黑龙江林蛙进行了种间鉴别。本研究还对中国林蛙和黑龙江林蛙生长激素(GH )基因进行研究,为进一步研究两种林蛙的林蛙油品质差异及分子鉴定奠定基础。本论文主要研究结果如下:   1.在尾分析法-RAPD 标记分析中,从126 个引物中筛选出3 个引物,S112 、C8 、C14 可以明显区分中国林蛙的三个地理居群,并可区分中国林蛙和黑龙江林蛙两种药源林蛙。   2.在RAPD 标记分析中,从80 个引物中筛选出20 个引物对两个地区的中国林蛙70 个样本进行了扩增。共扩增出143 条DNA 片段,其中129 条具有多态性,多态百分率为90.21%,每个引物可扩增5 ~12 条多态性条带,平均7.15 条。遗传相似系数变化范围为0.2657~0.9860 ,平均值为0.6454 。聚类分析显示,RAPD 标记能将供试材料区分开。多态条带比率、Shannon多样性指数以及Nei 基因多样性指数(h )均显示两个居群间存在较为丰富的遗传多样性。但是居群内部遗传多样性较低。采用Nei 遗传距离、Shannon 多样性指数、Gst 基因分化系数等方法对2 个地理居群进行遗传分化分析,结果表明两个地区居群间遗传分化程度较高,遗传变异主要来自居群间。   3.分别对中国林蛙和黑龙江林蛙GH 基因外显子4 部分序列,进行克隆测序。序列比对同源性达到97.12%。中国林蛙较黑龙江林蛙缺少三个碱基,有一个A 和G 改变。翻译成氨基酸中国林蛙有一个亮氨酸的缺乏。
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