9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮（9α-OH-AD）是制备倍他米松及地塞米松等甾体类药物的重要中间产物之一。在工业应用中,常使用谷甾醇、豆甾醇和菜油甾醇等植物甾醇作为底物,通过分枝杆菌等菌种生物转化获得9α-OH-AD。在此过程中,3-甾酮-9α-羟基化酶作为最关键的酶参与甾体母核上C_9α位的羟基化作用。因此,提高3-甾酮-9α-羟基化酶的活性对促进9α-OH-AD的合成具有极其重要的作用。本研究通过在大肠杆菌和分枝杆菌中分别克隆表达3-甾酮-9α-羟基化酶KsH基因,加强酶活,提高9α-OH-AD的生物转化率。首先,依据GenbanK中KshA与KshB的相似基因设计引物,以分枝杆菌的基因组为模板通过PCR技术手段获取KshA与KshB基因。基因克隆2个亚基基因,插入原核表达载体的双启动子pETDuet-1中,热击转化入E.coli BL21（DE3）系列宿主,得到多基因重组工程菌株,进行蛋白的表达及验证,成功构建了原核表达系统。其次,将KshA基因与酶切后的载体pNIT进行连接,获得了含有KshA基因的环状质粒pNIT-KshA。在pNIT-KshA的基础上,采用相同的方法构建完成pNIT-KshA-KshB,最后再将构建好的质粒电转化入到分枝杆菌中,得到一株阳性转化子M-KsH。发酵催化积累9α-OH-AD的实验结果表明,M-KsH积累9α-OH-AD产量比出发菌株提高了0.486 g/L,转化能力提高了50.78%。在摇瓶培养条件下,通过单因素优化和正交等试验设计法,优化发酵培养基和培养条件。最优培养基组成为（g/L）:蔗糖6、甘油20、酵母粉10、Na₂HPO₄·12H₂O 4、KH₂PO₄ 1、MgSO₄ 3、FeSO₄0.01、pH 8。得到的9α-OH-AD的产量为1.614 g/L,其产量比重组菌株优化前提高了11.85%。