目的:　　1.验证甲氨蝶呤（MTX）及顺铂是否能诱导肿瘤细胞的DNA双链断裂损伤。　　2.研究 DNA双链断裂损伤及同源重组修复通路是否参与介导人绒毛膜癌细胞的化疗高敏性。　　材料和方法:　　1．细胞系：（1）甲氨蝶呤高敏组：人绒毛膜癌细胞株 JAR，JEG-3；（2）甲氨蝶呤敏感组：骨肉瘤细胞株 MG63；（3）甲氨蝶呤不敏感组：上皮性卵巢癌细胞株A2780以及宫颈腺癌细胞株Hela；　　2．MTT法检测上述五株肿瘤细胞对甲氨蝶呤的敏感性，并根据半数抑制浓度（IC50）选择合适的药物处理浓度及浓度梯度。　　3．中性彗星实验检测甲氨蝶呤是否能诱导上述五株肿瘤细胞内的DNA双链断裂损伤；　　4．Western Blot检测甲氨蝶呤敏感细胞株中药物处理后DNA双链断裂损伤标志物γH2AX蛋白的表达水平；　　5．RT-PCR检测浓度梯度药物处理后上述五株细胞同源重组修复相关基因表达水平的差异；　　6．Western Blot验证同源重组修复差异蛋白的表达水平以及凋亡蛋白p53的表达变化。　　7．将甲氨蝶呤替换为顺铂，在两株人绒毛膜癌细胞株 JAR及 JEG-3中，重复MTT，中性彗星实验，RT-PCR和Western Blot试验。　　结果:　　1. MTT检测不同浓度的甲氨蝶呤处理人绒毛膜癌细胞 JAR、JEG-3、骨肉瘤细胞 MG63、上皮性卵巢癌细胞 A2780及宫颈腺癌细胞 Hela的药物敏感性。结果： JAR、JEG-3、MG63对甲氨蝶呤敏感，IC50分别是：28.39±3.02μM，23.70±2.58μM，30.92±3.51μM； A2780及Hela对甲氨蝶呤的IC50>400μM。　　2.用五株细胞对应的甲氨蝶呤IC50分别处理细胞24h和48h以后，通过中性彗星实验检测到 JAR、JEG-3细胞有明显拖尾现象，平均尾长分别为88.50±2.31μm、121.71±5.21μm；平均尾相分别为30.97±2.86、41.85±5.59。MG63细胞只有轻微的拖尾现象：平均尾长为47.54±2.52μm，平均尾相为14.65±3.29；各组细胞的平均尾长和平均尾相与对照组相比，P<0.05，差异有显著的统计学意义。而A2780和Hela细胞则未观察到细胞拖尾现象。　　3.Western Blot检测甲氨蝶呤以不同浓度及不同时间处理的JAR、JEG-3、MG63细胞中γH2AX蛋白的表达。结果：随着甲氨蝶呤作用浓度升高及作用时间的延长，绒癌细胞 JAR、JEG-3中γH2AX蛋白表达水平明显升高；在MG63细胞中γH2AX蛋白表达水平开始有略微升高，但随着药物作用浓度的增加和作用时间的延长，γH2AX蛋白表达水平降低或不表达。　　4. PCR检测甲氨蝶呤以不同浓度处理的JAR、JEG-3、MG63、A2780、Hela细胞中同源重组修复相关基因 RAD51、RAD52、BRCA1、BRCA2的表达。结果：甲氨蝶呤处理的JAR、JEG-3细胞中 RAD51的表达显著抑制，P<0.05,差异有统计学意义；而 RAD52、BRCA1、BRCA2的表达未见显著差异；MG63细胞中 RAD51的表达有轻微抑制，余基因未见明显改变；A2780、Hela细胞中四种关键的同源重组修复基因的表达水平均无差异。　　5.Western Blot检测甲氨蝶呤以不同浓度及不同时间处理的JAR、JEG-3、MG63细胞中 RAD51蛋白、p53的表达。结果：JAR、JEG-3细胞中RAD51的表达被抑制，p53表达升高，呈显著的浓度和时间依赖效应，而MG63中 RAD51蛋白的表达仅有轻微降低，p53表达量短暂升高，并随着刺激时间的推移，抑制效应解除，p53表达降低。　　6.顺铂以不同浓度和时间处理JAR、JEG-3细胞，重复上述实验步骤。结果：两株绒癌细胞JAR、JEG-3对顺铂都是极其敏感的，半数抑制浓度（IC50）分别为1.72±0.56μM，1.53±0.22μM。中性彗星实验检测顺铂以相应的IC50浓度分别处理两株绒癌细胞24h和48h后，未观察到明显的细胞拖尾现象。顺铂浓度梯度及时间梯度刺激后，细胞内γH2AX在高浓度及长时间作用下表达升高，相应的RAD51蛋白的表达水平也同步升高，而凋亡蛋白p53及Caspase3表达水平也随着顺铂处理浓度及时间的增加而升高。　　结论:　　1． MTX诱导人绒癌细胞持续性 DNA双链断裂损伤，同时其同源重组修复蛋白 RAD51的表达易被抑制，这种易损伤及低修复的特性可能介导其化疗高敏性；　　2．顺铂在一定条件下诱导人绒癌细胞 DNA双链断裂损伤及细胞凋亡，但并不通过调控同源重组修复通路，提示绒癌细胞中可能存在其他修复机制缺陷，有待进一步研究。