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本研究以五加科Araliaceae人参属Panax多年生草本植物珠子参PanaxjaponicusC.A.Mey.var.major(Burk.)C.Y.WuetK.M.Feng为材料,优化培养条件,通过组织培养的手段获取珠子参愈伤组织细胞系。运用HPLC方法分析不同产地珠子参野生样品及其培养细胞系样品的皂苷成分差异,通过对功效成分的分析选择适合的培养方式,并且初步建立珠子参总皂苷成分的HPLC图谱。利用人参属EST序列建立珠子参EST-SSR分析体系,探寻珠子参愈伤组织细胞系遗传结构。使用ITS测序手段获取样品ITS序列,对珠子参及其近缘种之间的遗传关系进行研究。
通过实验得出以下结果:
野生珠子参外植体在MS培养基,KT1.0mg·L-1+2,4-D2.0mg·L-1+6-BA2.0mg·L-1+NAA1.0mg-L-1的培养条件下可顺利诱导产生愈伤组织并进行继代培养,继代培养以悬浮培养和常规培养相结合为宜,且低温对愈伤组织的诱导和生长较为有利。
运用HPLC对珠子参皂苷成分进行分析,分析数据后得到共有峰图谱,发现人工培养珠子参愈伤组织细胞系样品总皂苷含量显著高于野生样品,并且总皂苷含量与培养时间成正比。
利用GenBank数据库中人参属EST。序列信息设计引物50对,通过实验成功建立珠子参EST-SSR体系。经过引物筛选后,共有38对引物具有扩增产物,占总设计引物数的76%;其中扩增产物基本符合预期产物大小的有23对,占总设计引物数的46%,说明人参属EST-SSR标记在珠子参中有较好的通用性。
经过ITS测序获得的样品序列,进行BLAST比对后,珠子参与羽叶三七Panaxvar.bipinnatifidus的序列同源性为100%,可以推断羽叶三七可能就是珠子参。将测序结果与NCBI中获得的珠子参近缘种序列相比对后,发现珠子参及其近缘种ITS序列差异极小,且同源性普遍较高。