花器喷雾法接种根癌农杆菌转化矮生菜豆条件的初步探索

来源 :中国农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:xinduolian1986
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目前菜豆基因转化研究的主要困难是植株再生系统难于建立和转化效率较低。农杆菌介导拟南芥的花器喷雾法(floral spray)是当前不需要组织培养及植株再生的最简单的转化方法,这种方法在其他作物上还没有成功应用。本论文是尝试将该方法用于转化矮生菜豆的研究。矮生菜豆生育期短,植株矮小直立,是比较理想的研究菜豆转化的材料。通过对农杆菌在矮生菜豆花器中的存活状况、vir基因的表达情况、T-DNA的转移情况的研究,初步探讨了该方法在农杆菌介导的矮生菜豆的遗传转化中的可行性。 为了更好的研究花器喷雾法的可行性,我们首先利用针刺注射花器的方法保证接种菌液进入到花器中去,对不同接种时期、不同接种菌液条件下的农杆菌存活、vir基因表达情况进行了研究。研究表明,接种的六个时期农杆菌存活都很好,vir基因表达水平也很高;接种菌液浓度(OD600值表示)为0.8—1.3时,vir基因表达最好;糖类物质以及细胞分裂素BAP能够大大提高vir基因的表达水平,其中蔗糖的效果比葡萄糖好;接种菌液中是否加入乙酰丁香酮AS对vir基因的表达水平没有影响。我们进一步利用在T-DNA上含有GUS基因的农杆菌菌株LBA4404(pTOK233)研究最佳接种时期,结果表明,最佳接种时期应在授粉之前,菜豆花现蕾的第一天到第二天。 花器喷雾法转化植物的难点在于接种菌液能否进入到花器中去,并到达靶标位置。研究表明表面活性剂可对其有所帮助。目前花器浸蘸法所常用的表面活性剂为Silwet L-77,本研究显示该试剂用于花器喷雾时对农杆菌进入矮生菜豆花器的帮助不大。然而我们选用EMCOL 4012、渗透剂T和MORWET EFW可有效地使农杆菌进入到矮生菜豆花器内。这表明,这些表面活性剂可能有利于使菌液进入到其它植物花器中,从而有助于在其它植物上进行高效的花器转化。这对用农杆菌进行花器转化的方法改良提供了新的方向。
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