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目的1.通过网络药理学技术、分子对接及Cytoscape可视化软件筛选出益气养阴活血方（精灵颗粒,YYHF）防治动脉粥样硬化的主要活性成分、核心靶点及潜在作用机制。2.结合网络药理学研究结果,采用UPLC-TQ/MS技术对YYHF中灵芝酸A、槲皮素、大黄素及虎杖苷四个活性成分进行鉴定和定量分析。3.利用体外细胞实验对YYHF抗动脉粥样硬化HUVECs细胞损伤的潜在作用机制进行验证。方法1.网络药理学:通过网络药理学技术靶向预测,利用TCMSP数据库筛选出YYHF的活性成分,应用SwissTargetPrediction进行活性成分的靶点预测;通过Disgenet数据库、GeneCards数据库、Drugbank数据库、OMIM数据库筛选出动脉粥样硬化的预测靶点;将药物活性成分和疾病靶点进行映射;利用STRING数据库和Cytoscape3.8.0软件构建“YYHF活性成分-疾病靶点”网络图并筛选出核心活性成分以及核心潜在靶点;应用AutDock Vina软件对核心活性成分与核心靶点进行分子对接;通过David分别进行KEGG通路富集分析和GO富集分析,对YYHF进行药理作用分析,得出YYHF治疗动脉粥样硬化的核心活性成分和潜在靶点及主要信号通路。2.UPLC-TQ/MS:采用超高效液相色谱-电喷雾三重四极杆质谱（UPLC-TQ/MS）技术对 YYHF 中 Ganoderic acid A（灵芝酸 A）、Quercetin（槲皮素）、Emodin（大黄素）及 Polydatin（虎杖苷）四个活性成分进行鉴定和定量分析。3.细胞实验:体外培养HUVECs细胞,将过氧化氢溶液（H202）用含0.2%牛血清白蛋白的DMEM（高糖）培养液配制成不同的浓度梯度,与HUVECs细胞共培养24小时,以细胞增值/毒性检测（Cell Counting Kit-8,CCK8）法检测不同浓度下H2O2溶液对HUVECs细胞的损伤程度,以考察出合适的造模浓度;将YYHF冻干粉用含血清的DMEM（高糖）培养液配制成不同的浓度梯度,与HUVECs细胞共培养24h,以CCK8法检测YYHF对HUVECs细胞的增值作用,以考察出合适的给药浓度进行后续实验;将灵芝酸A用含血清的DMEM（高糖）培养基配制成不同的浓度梯度,与HUVECs细胞共培养24h,以CCK8法检测YYHF对HUVECs细胞的增值作用,以考察出合适的给药浓度进行后续实验;以浓度为250μlg/ml的YYHF与HUVECs细胞共培养24h后,给予含H2O2溶液浓度为300μmol/L的含血清的DMEM（高糖）培养液干预HUVECs细胞24h,通过细胞形态学观察及细胞划痕实验观察YYHF对H2O2所致HUVECs细胞损伤创口愈合速度的影响;通过Hoechst 33342染色法检测YYHF对H2O2所致HUVECs细胞损伤的保护作用;通过 Western Blot 检测 YYHF 对 HUVECs 细胞 P53、BAX、BCL-2、AKT、PI3K、p-AKT、p-PI3K蛋白表达水平的影响。结果1.活性成分:在TCMSP数据库中,根据OB≥30%和DL≥0.18参数筛选可初步获得黄精活性成分12个,灵芝活性成分61个,绞股蓝活性成分24个,虎杖活性成分10个,漏芦活性成分5个,姜黄活性成分3个。此外,姜黄中的姜黄酮醇A（turmeronolA）、姜黄酮醇B（turmeronol B）、甜没药姜黄醇（bisacumol）[1]、姜黄素（Curcumin）,虎杖中的虎杖苷（Polydatin）、白藜芦醇苷（Resveratrol）、大黄素（Emodin）,以及漏芦中的亚油酸（EIC）和石竹素（（-）-Caryophyllene oxide）,因筛选时其OB值与DL值不能够满足筛选条件而未入选,但通过文献检索考虑其实际的药理学意义而决定将其均纳入选择。2.核心靶点:蛋白质互作网络结果显示IL6、IL-1、ALB、AKT1、TNF、VEGFA、MAPK3、SRC、EGFR、CTNNB1、PPARG、PPARA 等可能为 YYHF 防治动脉粥样硬化的核心靶点;分子对接的结果表明灵芝酸A与核心靶点之间均具有较高的结合活性。3.GO功能富集分析:共富集到1433个条目,包括生物过程（BP）相关条目1067个,主要涉及RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、炎症反应、细胞增殖的正调节、G蛋白偶联受体信号通路、凋亡过程的负调控等;细胞组成（CC）条目127个,主要包括细胞内区域部分、膜封闭腔、细胞器部分等;分子功能（MF）条目239个,主要涉及蛋白质结合、ATP结合、酶结合等。4.KEGG信号通路富集分析:共富集到181条信号通路,主要包括PI3K-Akt信号通路、癌症的途径、Rap1信号通路、Ras信号通路、MAPK信号通路、流体剪切应力和动脉粥样硬化信号通路、Toll样受体信号通路等。5.实验结果:利用已建立的标准曲线计算颗粒剂中灵芝酸A、槲皮素、大黄素及虎杖苷四个成分的含量分别为 0.385912mg/g、0.026743mg/g、0.371451mg/g 及 0.817258mg/g;CCK8结果表明人脐静脉内皮细胞H2O2损伤的合适造模浓度为300μmol/L,YYHF合适的给药浓度为250μg/mL,灵芝酸A合适的给药浓度为20μM;细胞划痕实验结果显示YYHF对HUVECs细胞划痕创面的愈合具有明显的促进作用;Hoechst 33342染色法结果显示YYHF对H2O2所致HUVECs细胞损伤具有保护作用;Western Blot法结果显示YYHF能够上调p-PI3K蛋白、p-AKT蛋白及BCL-2蛋白的表达水平,下调P53蛋白、BAX蛋白的表达水平,抑制细胞凋亡。结论1.网络药理学及分子对接结果表明YYHF中的活性成分灵芝酸A与核心靶点蛋白具有较高的结合活性;YYHF可能通过参与炎症反应、细胞增殖的调控、凋亡过程的负调控等生物过程,调控PI3K-Akt信号通路、癌症的途径、Rap1信号通路、Ras信号通路、MAPK信号通路、流体剪切应力和动脉粥样硬化信号通路、Toll样受体信号通路等信号通路发挥抗动脉粥样硬化的作用。2.实验研究表明YYHF能够上调p-PI3K蛋白、p-AKT蛋白及BCL-2蛋白的表达,抑制BAX蛋白、P53蛋白的表达,作用机制可能在于YYHF能够激活P13K/Akt信号通路发挥抗HUVECs细胞凋亡从而发挥抗动脉粥样硬化作用。