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猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是一种严重危害世界养猪业的病毒性传染病,其病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)。PRRSV的非结构蛋白(Nsp)在病毒复制、免疫抑制中的生物学功能及其与宿主细胞蛋白的相互作用成为近年来的研究热点。本研究通过分析PRRSV Nsp9和宿主细胞视网膜母细胞瘤蛋白(pRb)的相互作用及其分子机制,揭示Nsp9在PRRSV复制和对宿主细胞周期调控中的作用,为阐明PRRSV的致病机制提供科学依据。首先对17株PRRSV代表性毒株的Nsp9氨基酸序列进行了比对分析。结果表明,这些毒株的Nsp9均存在有与pRb结合的基序LXCXE (LACAE)。用RT-PCR扩增出大小为1914bp并含有LXCXE基序的截短的pRb基因片段,构建出其真核表达质粒(pCMV-Myc-pRb-tru);同时,构建出表达Nsp9的真核表达质粒(pCMV-HA-Nsp9)和LACAE基序突变的Nsp9真核表达质粒[pCMV-HA-Nsp9(L415A/C417A)、PCMV-HA-Nsp9(E419K)].将pCMV-Myc-pRb-tru分别与pCMV-HA-Nsp9、pCMV-HA-Nsp9(L415A/C417A)、pCMV-HA-Nsp9(E419K)共转染HEK293T细胞,利用免疫沉淀技术证实Nsp9可通过LACAE基序与pRb相互作用。用pCMV-Myc-pRb-tru和pCMV-HA-Nsp9共转染MARC-145细胞,以及用PRRSV感染MARC-145细胞和猪肺泡巨噬细胞(PAMs),进行激光共聚焦显微镜分析。结果显示,过表达的Nsp9和pRb-tru能够在转染的MARC-145细胞胞质中共定位；在PRRSV感染的细胞MARC-145细胞和PAMs中,Nsp9能够和内源性的pRb共定位于细胞质。利用表达pRb的慢病毒或pRbsiRNA,转导或转染MARC-145细胞,分析了pRb过表达和干扰对PRRSV增殖的影响。结果表明,pRb过表达能够抑制PRRSV复制,与对照组相比,病毒滴度显著降低(p<0.001)；pRb干扰有利于PRRSV复制,病毒滴度显著高于对照组((p<0.001或p<0.01)。由此说明,宿主细胞蛋白pRb对PRRSV的增殖具有抑制效应。经Western blotting分析表明,PRRSV感染能够下调宿主细胞pRb水平；降解试验和泛素化分析表明,PRRSV Nsp9能够促进宿主细胞蛋白pRb的泛素化降解。由此说明,PRRSV Nsp9可通过泛素蛋白酶体途径下调宿主细胞蛋白pRb水平,拮抗pRb对PRRSV复制的抑制作用,从而利于病毒增殖。进一步分析了PRRSV Nsp9降解宿主细胞蛋白pRb的分子机制。利用免疫共沉淀证实了E3泛素连接酶E6AP与pRb及Nsp9形成复合体。激光共聚焦免疫荧光分析表明,不论是在过表达Nsp9和E6AP,pRb和E6AP的MARC-145细胞中,还是在PRRSV感染的MARC-145细胞和PAMs中,Nsp9和E6AP, pRb和E6AP均能共定位于胞质中。降解试验和泛素化试验结果表明,Nsp9可促进E6AP对pRb的泛素化降解。采用免疫共沉淀分析了Nsp9分子中与E6AP相互作用的区域。结果显示,Nsp9的N端与E6AP发生相互作用。这些结果表明Nsp9的RdRp结构域可招募pRb到E6AP上,进而促进E6AP对胞质中pRb的泛素化降解。分析了PRRSV Nsp9与pRb相互作用对细胞功能的影响。利用双荧光素酶报告试验检测Nsp9对E2F反应启动子p107的激活情况。结果表明,Nsp9能特异性地激活p107启动子。Western blotting分析表明,Nsp9能提高p107水平。流式细胞术分析结果表明,Nsp9与pRb相互作用可促进细胞周期进入S期。这些结果说明,Nsp9与pRb相互作用可特异性地激活E2F反应启动子p107,从而调节细胞周期进程。为了分析细胞周期变化对PRRSV增殖的影响,我们利用aphidicolin和DMSO处理细胞,使细胞周期分别停滞于G1和s期,检测对PRRSV增殖的影响。结果表明,S期的延长能够显著增加病毒滴度(p<0.001)。综上所述,Nsp9可招募pRb到E6AP上,促进E6AP对胞质中pRb的泛素化降解,激活E2F反应启动子p107,促进细胞周期进入S期,利于病毒复制。以上研究结果为深入阐明Nsp9在PRRSV复制及致病机制中的作用提供了科学依据。