第一部分:RNF6促进多发性骨髓瘤细胞增殖目的:RNF6属于环指蛋白家族的E3泛素连接酶。最近的研究发现RNF6在多种肿瘤中发挥了重要作用,包括前列腺癌、结肠直肠癌、乳腺癌和白血病等。然而,RNF6在血液系统第二常见的恶性肿瘤-多发性骨髓瘤中的功能还没有报道。在初步的研究中,我们发现RNF6在骨髓瘤细胞中有很高的表达,并且增加了糖皮质激素受体GR的蛋白水平,而GR是治疗MM主要药物地塞米松(DEX)的作用受体,但RNF6作用GR的具体功能和机制尚不清楚。因此,本部分主要研究RNF6与GR在MM细胞增殖中的调控作用。方法:1.检索公共数据库“Oncomine”,分析RNF6在MM患者和细胞系中的表达情况;采用MTT比色法对RNF6存在时MM细胞的增殖进行评价。2.采用Western Blot法分析MM细胞中RNF6蛋白与GR蛋白的相关性;同时,用DEX、阿霉素DOX和喹啉类似物5AHQ处理MM细胞,对RNF6和GR进行检测分析。3.用携带RNF6或shRNF6的慢病毒(pLVX-RNF6或shRNF6)感染MM细胞,通过Western Blot法分析细胞中GR蛋白水平的变化,免疫沉淀/免疫印迹(IP/IB)法分析RNF6对GR泛素化水平的影响。4.通过核质分离和Western Blot法分析RNF6过表达对GR亚定位的影响;利用荧光素酶报告基因法检测RNF6对GR转录活性的影响;RT-PCR和WB法检测GR下游基因的mRNA水平和蛋白水平。5.质粒转染或慢病毒感染后,WB法检测RNF6对AKT/mTOR/GSK3β信号通路的影响。6.采用免疫共沉淀法(Co-IP)检测DEX对RNF6与GR结合的影响;采用WB和MTT法分析RNF6对MM细胞药物敏感性的影响。结果:1.从“Oncomine”检索的数据中发现,与正常骨髓样本相比,MM患者的RNF6表达水平较高;并且,随着MM的进展,其表达水平逐渐升高;RNF6的高表达在MM细胞系中得到进一步证实。同时,当RNF6被敲除后,MM细胞增殖将减慢。2.RNF6与GR在MM细胞中的表达水平呈现正相关性;在药物抑制实验中,我们发现DEX、DOX和5AHQ以剂量依赖的方式下调RNF6和GR的蛋白水平。3.RNF6增加了 MM细胞中内源性GR的蛋白水平;此外,它还显著抑制了 DEX诱导的GR蛋白的降低。和预期的结果一致,作为泛素连接酶,RNF6显著调节工具细胞中和MM细胞中GR的泛素化水平。4.RNF6促进了 DEX诱导的GR核转位;与此一致的是,RNF6以剂量依赖和RING结构域依赖的方式促进了 pGRE-luc活性,这表明泛素连接酶活性对RNF6调节GR稳定性和功能至关重要;根据这一发现,RNF6上调了 GR两种典型的下游基因 BCL2L1 和 Mcl-1 的 mRNA 水平,Western Blot 检测显示 RNF6 上调了 Bcl-xL 和Mcl-1的蛋白水平。5.出人意料的是,我们发现RNF6过表达能上调p-AKT/p-mTOR/p-GSK3β的蛋白水平,并依赖于RING结构域的存在。6.DEX能干扰RNF6与GR的相互作用,而RNF6过表达部分降低了 MM细胞对DEX的药物敏感性。小结:RNF6在原发性MM患者和细胞系中均有高表达,能显著促进MM细胞的增殖。RNF6与MM细胞中GR的表达呈正相关,均可被抗MM的药物下调。RNF6能够稳定MM细胞中GR的蛋白水平,诱导GR的K63泛素化,促进GR的核定位,上调其转录活性。此外,RNF6上调了 p-mTOR、p-AKT、p-GSK3β的蛋白质含量,从而参与AKT/mTOR信号通路的调节。同时,RNF6可以与DEX竞争性结合GR蛋白,从而拮抗DEX诱导的MM细胞凋亡。第二部分:去泛素酶USP7稳定RNF6的机制目的:在泛素-蛋白酶体系统的6个组分(Ub、E1、E2、E3、蛋白酶体和DUB)中,大多数蛋白的泛素化依赖于外源性E3连接酶。但一些蛋白质,如环指蛋白家族连接酶,可以进行自身泛素化。因此,本部分将重点研究(1)RNF6的自身泛素化;(2)RNF6去泛素酶的鉴定。方法:1.用氯喹、硼替佐米、MG132等多种蛋白水解抑制剂处理MM细胞,分析RNF6蛋白的降解途径。通过质粒转染后的IP/IB检测RNF6的泛素化水平。2.采用液相色谱(LC)/串联质谱(MS/MS)技术对RNF6泛素化相关酶进行了鉴定。采用IP/IB法分析了 RNF6、USP7和USP9X之间的相互作用。3.质粒转染或慢病毒感染后,IP/IB法分析USP7存在下RNF6的泛素化水平;利用缺失突变构建USP7的截断体序列,共转染分析USP7截断体对RNF6泛素化水平的影响,确定USP7的关键功能域。4.WB法检测USP7存在下RNF6蛋白水平;采用CHX chase测定在USP7存在下RNF6的半衰期。5.用USP7小分子抑制剂P5091验证了 USP7对RNF6泛素化、稳定性以及MM细胞增殖和凋亡的影响。结果:1.蛋白酶体抑制剂硼替佐米和MG132均能显著增加RNF6的蛋白水平,且呈剂量依赖性,而溶酶体抑制剂氯喹则不能。MG132显著提高了 RNF6的泛素化水平,说明RNF6受泛素-蛋白酶体通路调控。此外,全长的RNF6蛋白能够泛素化RING结构域缺失的蛋白(ΔRING);相反当RING结构域被删除后,RNF6的泛素化能力就丧失了。这些发现表明RNF6能够形成自身泛素化,且RING结构域发挥了重要作用。2.利用LC-MS/MS策略,我们发现RNF6和RNF6△RING免疫沉淀中均存在去泛素酶USP7和USP9X。随后的细胞检测发现,HEK293T细胞的Co-IP中同时存在RNF6、USP7和USP9X。此外,内源性USP7蛋白免疫沉淀后,在MM细胞中检测到USP9X与RNF6的内源性结合。这些结果表明,USP7/USP9X可能协同调控RNF6泛素化和稳定性。3.USP7以剂量依赖的方式显著抑制RNF6的泛素化水平,特别是K48泛素化。此外,通过共转染RNF6和一系列USP7截断体,发现TRAF结构域对于USP7抑制RNF6泛素化至关重要。4.USP7上调RNF6蛋白水平呈时间和剂量依赖性,但对其mRNA表达无影响。此外,CHX chase实验显示,USP7过表达显著抑制了 RNF6的降解速率。所有这些发现共同表明,USP7通过阻止RNF6的泛素化和降解来稳定RNF6。5.USP7小分子抑制剂P5091,对RNF6蛋白水平的抑制作用呈剂量依赖性。与这一结果一致的是,P5091可以显著提高MM细胞中内源性RNF6的K48位泛素化水平。此外,CHX chase实验显示,P5091加速了 RNF6的降解速度。小结:RNF6蛋白受泛素-蛋白酶体途径调控。作为RING型泛素连接酶,RNF6可依赖于RING结构域进行自泛素化。LC-MS/MS策略确定了 USP7与RNF6存在相互作用。作为一种去泛素化酶,USP7可以阻止RNF6的K48位泛素化和RNF6的降解。与这一结果一致的是,小分子抑制剂USP7可显著诱导RNF6的K48位泛素化水平,从而导致RNF6降解和MM细胞凋亡。结论RNF6是RING型E3泛素连接酶的成员之一,通过调节特异性底物蛋白的泛素化和稳定性来促进多种肿瘤的恶性增殖,但其在MM中的作用尚未见报道。在本研究中,我们发现:(1)RNF6在MM细胞中高度表达,促进MM细胞增殖。(2)RNF6与GR结合,介导其K63泛素化,从而稳定GR。(3)RNF6增强了 GR的转录活性,增加了促生存基因Bcl-xL和Mcl-1的表达,说明了 MM细胞对DEX具有耐药性。(4)RNF6通过其RING结构域进行自身泛素化。(5)LC-MS/MS确认了 USP7与RNF6相互作用。(6)去泛素化酶USP7可以阻止RNF6泛素化。(7)抑制USP7导致RNF6降解和MM细胞凋亡。(8)USP7/RNF6轴可能是治疗MM的一个新的药物靶点。