在慢性感染或癌症的发生过程中,T细胞长期暴露于持续的抗原刺激或炎症信号,导致T细胞以分级的方式逐渐失去效应功能,通常称为T细胞耗竭（T cell exhaustion）。T细胞表面PD-1、CTLA-4、LAG-3、Tim-3和BTLA等抑制性受体高表达和共表达是耗竭T细胞的主要特征之一。本课题组前期的研究中,已经用差速离心法从多种小鼠/人肿瘤细胞培养上清以及肿瘤患者胸/腹水中成功募集到分泌型自噬小体,并命名为肿瘤细胞释放的自噬小体（Tumor cell-released autophagosome,TRAP）。后续研究进一步发现在肿瘤微环境中TRAPs可以诱导B细胞成为具有免疫抑制功能的IL-10⁺Breg细胞;诱导巨噬细胞向M2型极化,并且高表达PD-L1;通过触发中性粒细胞产生ROS并诱导caspase-3活化,进而促进中性粒细胞凋亡;以及诱导CD4⁺T细胞分泌IL-6抑制T细胞功能,促进肿瘤的生长与转移。但是,TRAPs是否参与诱导T细胞表面抑制性受体的表达及其机制尚未完全清楚。目的:本文拟探讨TRAPs诱导T细胞表面抑制性受体表达及其耗竭的分子机制,为逆转耗竭T细胞增强肿瘤免疫治疗提供新的思路。方法:1.TRAPs对T细胞表面抑制性受体表达的影响1)用差速离心法募集肿瘤细胞培养上清中的TRAPs,然后分别用Western blot和流式细胞术来鉴定TRAPs的纯度,NTA检测TRAPs的粒径。2)分离小鼠脾细胞体外在αCD3/CD28抗体的培养体系下,加入TRAPs体外诱导培养72小时,用流式细胞术检测CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞表面PD-1、CTLA-4、LAG-3、Tim-3和BTLA的表达情况。随后,在上述培养体系下,加入不同浓度的TRAPs体外诱导培养72小时,流式细胞术检测CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞表面LAG-3的表达水平。3)分离小鼠脾细胞在αCD3/CD28抗体的培养体系下,加入TRAPs体外诱导培养72小时,流式细胞术检测CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞表面PD-1与CTLA-4、LAG-3、Tim-3、BTLA共表达情况。4)分离小鼠脾细胞在αCD3/CD28抗体的培养体系下,分别加入不同浓度的TRAPs体外诱导培养72小时,流式细胞术检测CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞IFN-γ表达情况。2.TRAPs诱导T细胞高表达LAG-3的分子机制研究1)分别用WT、TLR2^–/–、TLR4^–/–和MyD88^–/–小鼠脾细胞在αCD3/CD28抗体的培养体系下,加入TRAPs体外诱导培养72小时,用流式细胞术检测CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞表面LAG-3表达情况。2)分离WT小鼠脾细胞在αCD3/CD28抗体的培养体系下,加入αIL-6中和抗体和TRAPs,或分离IL-6^–/–小鼠脾细胞在αCD3/CD28抗体的培养体系下,加入TRAPs后,体外诱导培养72小时,用流式细胞术检测CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞表面LAG-3的表达情况。3)分别用不同浓度STAT3抑制剂（Stattic）、JAK2/STAT3抑制剂（AG490）和JAK1/JAK2/STAT3抑制剂（CYT387）预处理小鼠脾细胞1小时,再在αCD3/CD28抗体的培养体系下,加入TRAPs体外诱导培养72小时,用流式细胞术检测CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞表面LAG-3的表达情况。3.TRAPs诱导T细胞高表达LAG-3的功能研究1)将小鼠脾细胞在αCD3/CD28抗体培养体系中,加入TRAPs体外诱导培养72小时,收集细胞并用PBS洗一遍,获得正常培养的脾细胞(SP_CM)和TRAPs诱导并高表达LAG3的脾细胞组(SP_TRAP)。然后将上述两组脾细胞重新加入24孔板中,在αCD3/CD28抗体培养体系下,分别加入BMDM混合培养或用Transwell小室隔离培养,其中TRAPs诱导的脾细胞种于下室,BMDM种于上室,培养24小时后,用流式细胞术检测CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞IFN-γ表达情况。1)分离小鼠脾细胞在αCD3/CD28抗体培养体系下,加入TRAPs体外诱导培养72小时,收集细胞并用PBS洗一遍,获得TRAPs诱导的脾细胞(SP_TRAP),然后将其重新铺板,在αCD3/CD28抗体培养体系下,加入αLAG-3和αPD-L1抗体单独和联合预处理后,再加入BMDM混合培养24小时,流式细胞术检测CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞IFN-γ表达情况。结果:1.TRAPs对T细胞表面抑制性受体表达的影响2)差速离心法可从Hepa1-6肿瘤细胞培养上清中提取到纯度大于90%的分泌型自噬小体,粒径主要在200-400（nm）之间。3)TRAPs处理后的小鼠脾细胞中,CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞表面PD-1、CTLA-4、LAG-3、Tim-3和BTLA的表达明显上调,其中LAG-3的上调最为显著,并随着TRAPs浓度的增高,其表面LAG-3的表达水平也逐渐升高。4)TRAPs处理后的小鼠脾细胞中PD-1⁺CTLA-4⁺、PD-1⁺LAG-3⁺、PD-1⁺Tim-3⁺、PD-1⁺BTLA⁺的CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞表达明显增多。5)TRAPs处理后的小鼠脾细胞中,CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞分泌的IFN-γ的量明显下降,并且随着TRAPs浓度依次增加,IFN-γ的表达也逐渐减少。2.TRAPs诱导T细胞高表达LAG-3的分子机制研究1)TRAPs处理后的WT和TLR4^–/–小鼠CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞表面LAG-3的表达明显增高,而TLR2^–/–和MyD88^–/–小鼠的CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞表面LAG-3的表达变化不明显。2)加入IL-6中和抗体后,TRAPs处理后的WT小鼠脾细胞中CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞表面LAG-3的表达显著降低,其表达量基本与未经TRAPs处理的LAG-3的表达量相当。TRAPs处理后的IL-6^–/–小鼠的CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞表面LAG-3的表达变化不明显。3)STAT3抑制剂Stattic、JAK2/STAT3抑制剂AG490和JAK1/JAK2/STAT3抑制剂CYT387都可以显著抑制TRAPs诱导T细胞表面LAG-3的表达。3.TRAPs诱导T细胞高表达LAG-3的功能研究1)在正常培养的脾细胞(SP_CM)组中,加入BMDM共培养对CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞分泌IFN-γ的水平基本没有影响;而在TRAPs诱导的脾细胞(SP_TRAP)组中,加入BMDM混合共培养后,CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞分泌IFN-γ的量明显减少。Transwell小室将BMDM与SP_TRAP隔离培养后发现CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞分泌IFN-γ的量又显著恢复,与SP_TRAP细胞未加入BMDM组中T细胞分泌IFN-γ的水平相当。2)加入BMDM细胞组中CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞IFN-γ的表达水平显著下降;当单独用αLAG-3抗体封闭时,CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞IFN-γ的表达水平没有明显变化;单独用αPD-L1抗体封闭时,能够恢复BMDM对CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞IFN-γ的抑制;而αLAG-3和αPD-L1抗体联合封闭时,CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞IFN-γ的表达显著增高,并且高于αPD-L1抗体单独封闭时IFN-γ的表达水平。结论:1.TRAPs可以上调表达CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞抑制性受体（包括:PD-1、CTLA-4、LAG-3、Tim-3和BTLA等）,同时抑制CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞分泌IFN-γ;2.TRAPs主要通过TLR2-MyD88信号通路诱导脾细胞分泌IL-6,依赖IL-6并通过JAK/STAT3信号通路诱导CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞LAG-3的表达;3.单独阻断LAG-3对T细胞功能的恢复不起作用,当联合阻断PD-1/PD-L1时,可以进一步增强T细胞的功能。