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假单胞菌广泛分布在植物、土壤、海洋等自然环境中,是一类常见的革兰氏阴性菌。假单胞菌合成一类环脂肽类次级代谢产物,在生物表面活性剂、抗菌活性等方面具有重要的作用,可作为植物根际促生菌去抑制植物病原菌、促进植物的生长。因此被作为生防菌株广泛应用于农业领域。实验室前期筛选到一株可以合成环脂肽的菌株--Pseudomonas sp.G4(下文简称菌株G4),通过抑菌活性、表面活性检测发现其具有良好的抗生活性。通过质谱分析,初步鉴定其合成的环脂肽可能为一类新的环脂肽。但菌株自身合成环脂肽的产量低,并且调控网络复杂,不利于发挥其作为生防菌株的功能。研究发现Gac/Rsm系统调节多种环脂肽的合成,并且Hfq蛋白作为全局调控因子也可以调节多种脂肽类物质的合成。因此研究环脂肽合成的调控机制,不仅可以使其产量提高,还可以为定向高产菌株和生防菌株的开发、新型菌剂的研制提供新思路和充足的材料。本课题先在基因水平和产物水平上确认菌株G4合成的环脂肽结构及合成途径,并预测Gac/Rsm系统及Hfq蛋白的存在;其次通过一系列敲除、回补、实时定量PCR及表型实验来验证Gac/Rsm系统和全局调控因子Hfq对菌株G4合成环脂肽的调控。(1)基因组水平和产物水平分析菌株G4合成环脂肽的结构及其合成途径:通过antiSMASH预测菌株G4合成的次级代谢产物,分析Cluster 7产生的NRPS并利用NRPS-A结构域构建系统发育树。从基因水平上确定了脂肽化合物的结构,是一种新的环脂肽,暂时命名为Arthro-Like。并根据其NRPS编码基因,预测出Arthro-Like的生物合成途径。在产物水平,利用LC-MS分析了环脂肽的结构,与基因水平分析得到的结果一致,并发现其还有同系物的存在。(2)基因组水平预测菌株G4环脂肽合成的转录后水平的调控网络:通过NCBI-blast同源序列比对及G4的基因组信息,确定了 Gac/Rsm系统中GacS,GacA,RsmA和RsmE四个核心因子及全局调控因子Hfq的存在;根据G4的基因组信息及MFOLD(37℃折叠)程序中sRNA的二级结构、GGA基序及其所在位置的预测分析,筛选出4条可能参与Gac/Rsm系统的sRNA;通过RsmA/E结合靶向基因的保守基序5 ’-WCANGGANGW-3 ’,在菌株G4基因组中搜索获得2个位于Cluster 7环脂肽合成基因簇的上下游的mRNA靶基因--编码LuxR类型的转录调控因子。通过系统发育树分析,进一步确定了其为Gac/Rsm系统调控的直接靶基因--LuxR类型转录调控因子,分别暂时命名为G4_LuxRU和G4_LuxRD。(3)gacA基因对菌株G4环脂肽合成的调控作用:利用自杀载体pknock-Gm获得G4-gacA基因突变株,利用表达载体pME6032获得G4-gacA基因回补株。表型实验及HPLC检测显示:gacA基因突变后环脂肽产量减少,gacA基因回补后环脂肽产量有一定恢复。这说明GacA蛋白在菌株G4环脂肽合成中,发挥正调控作用。实时定量PCR结果显示:当gacA基因突变后RsmY的表达下调,而RsmZ的表达基本没有变化,阻遏蛋白RsmA、RsmE的表达均下调,LuxRU和LuxRD的表达均下调。说明在Gac/Rsm调控通路中GacA蛋白被激活后结合于RsmY的GacA box调控环脂肽的合成,且GacA蛋白在该通路中发挥正调控因子的作用。(4)阻遏蛋白RsmA对菌株G4环脂肽合成的调控作用:利用自杀载体pknock-Gm获得G4-rsmA基因突变株,利用表达载体pME6032获得G4-rsmA基因回补株。表型实验显示:rsmA基因突变后,菌株的排油活性和群集运动性有所减弱,HPLC检测显示:菌株产Arthro-like及同系物的种类几乎没变化,但产量略有所增加;将rsmA基因回补后,菌株的排油活性与突变株相比没有明显差异,但菌株的群集运动性又有所恢复,且HPLC检测发现菌株产Arthro-like及同系物的产量又有所减少。这说明在菌株G4中,RsmA蛋白不调控环脂肽的合成。实时定量PCR结果显示:当rsmA基因突变后另一个阻遏蛋白RsmE的表达下调,RsmY的表达上调而RsmZ的表达下调,LuxRU的表达没有明显变化而LuxRD的表达下调。说明在菌株G4中,阻遏蛋白RsmA通过结合RsmY来发挥作用,并且正调控RsmE、RsmZ 和 LuxRD 的表达。(5)hfq基因对菌株G4环脂肽合成的调控作用:利用表达载体pME6032获得G4-hfq过表达株。生长曲线结果显示,hfq基因过表达后,菌株在进入稳定期前生长速度有所加快,但进入稳定期的时间不变,说明Hfq不影响菌株G4的生长。表型实验显示,hfq基因过表达后菌株G4合成环脂肽的产量减少。说明Hfq蛋白在菌株G4环脂肽的合成中是一个负调控因子。实时定量PCR结果显示,将hfq基因过表达后,RsmY的表达上调,而RsmZ的表达下调,推测在菌株G4中,Hfq蛋白可能结合于RsmY增加其稳定性;LuxRU和LuxRD的表达均显著下调,推测在菌株G4中,Hfq蛋白结合于LuxRU和LuxRD来调控环脂肽的合成,且在该调控中发挥负调控因子的作用。