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胰高血糖素样肽-1(Glucagon like peptide-1,GLP-1)具有刺激胰岛素的生物合成和分泌,促进胰腺β细胞的增殖并抑制其凋亡,抑制胰高血糖素的分泌等多种生理功能,有望成为治疗2型糖尿病的新药物,但是GLP-1在体内迅速被二肽基肽酶Ⅳ(DPPⅣ)降解,限制了其临床应用。为克服该缺点,本实验室前期通过重叠PCR将两个GLP-1突变串联体分子与一个人血清白蛋白HSA分子融合((GLP-1A2G)2-HSA,简称GGH),构建重组表达质粒pPIC9K-GGH,并实现了其在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中的表达,得到一株高产菌GS115／F2。该融合蛋白GGH在患病小鼠体内不仅具有较好的降血糖和修复胰岛的功效,而且72 h在体内仍具有生物活性。
为了实现转化子的高通量筛选,建立了一个高通量的筛选模型,即原位杂交双膜法。原位杂交双膜法是一种基于免疫学原理的快速筛选高表达毕赤酵母转化子的方法,首先将刚电转之后的转化子涂布在醋酸纤维素膜上,再利用硝酸纤维素膜原位捕获穿过醋酸纤维素膜的菌落分泌蛋白,然后用免疫方法检测与硝酸纤维素膜结合的蛋白,最后挑选显色深浅不一的菌落进行摇瓶培养,结果证明,原位双膜法所得的染色强度与该菌落液体诱导表达水平正相关。
为了实现人胰高血糖素样肽-1-人血清白蛋白融合蛋白GGH的规模化制备,本文通过pPICZαB与pPIC9K双质粒共表达体系提高融合蛋白GGH在毕赤酵母中的表达量。首先运用PCR技术扩增出融合蛋白GGH的基因片段,构建了表达质粒pPICZαB-GGH,并电转至经载体pPIC9K-GGH异位整合的GGH分泌型菌株——毕赤酵母GS115／172；然后采用原位杂交双膜法并结合高浓度抗生素筛选获得高产菌GS115／F3,于30℃,诱导浓缩比为3:1的条件下3％甲醇诱导80 h,融合蛋白GGH的表达量达到了491 mg／L,较GS115／F2提高了49.7％。通过荧光定量PCR发现GGH基因拷贝数在含有双质粒体系的GS115／F3中较出发菌株GS115／F2提高了26.7％。Western blotting杂交表明融合蛋白同时具有人血清白蛋白和人胰高血糖素样肽-1的抗原性。在5L发酵罐放大实验中,采用分批补料发酵,1％浓度的甲醇脉冲式诱导80 h后菌浓OD600达到了250左右,蛋白产量达到了800 mg／L以上。