论文部分内容阅读
目前,癌症已经成为了造成人类死亡的重要原因,严重影响人类的生命安全。传统的治疗方法,包括手术治疗、化疗和放疗,对癌症有一定的疗效,但是其有限的治疗效果和严重的毒副作用使其仍然不能满足临床需求。随着纳米技术的发展及在影像学和肿瘤分子生物学中的不断应用,为癌症的早期诊疗提供了更加有效的策略。在本论文的研究中,将纳米材料氧化石墨烯与化药治疗相结合,实现了聚乙二醇(PEG)功能化的氧化石墨烯负载鬼臼毒素(PPT)的还原型谷胱甘肽(GSH)响应型前药DCM-S-PPT活体肿瘤增殖的抑制;将聚乙烯亚胺(PEI)功能化的嵌入式双介孔二氧化硅纳米球(EDMSNs)与基因治疗(CD/5-FC自杀基因系统)联合,达到了活体内有效治疗HCT116移植瘤的效果。本论文的研究内容和主要结论总结如下:1,通过共价结合的方式将六臂PEG-NH2与羧基化的氧化石墨烯结合,得到了 PEG功能化的氧化石墨烯(GO-PEG),接下来通过π-π堆积和疏水相互作用的方式将鬼臼毒素的GSH响应型前药DCM-S-PPT负载到GO-PEG的表面,得到 GO-PEG/DCM-S-PPT。在细胞水平上考察了 GO-PEG/DCM-S-PPT 对不同 GSH含量细胞的影响。在活体水平上,通过尾静脉注射的方式研究了 GO-PEG/DCM-S-PPT对小鼠HeLa移植瘤的抑制效果。研究表明:合成的GO-PEG在生理溶液中具有较好的稳定性;GO-PEG对细胞增殖影响较小,具有较好的生物相容性,为后续作为纳米药物传递载体提供了可能性;将DCM-S-PPT负载到GO-PEG表面,GO-PEG/DCM-S-PPT能够与GSH含量高的HeLa细胞内GSH发生特异性反应,释放PPT毒性分子,影响癌细胞HeLa的细胞活性,同时有利于减少PPT对低GSH含量的非癌细胞的毒副作用;动物实验表明GO-PEG/DCM-S-PPT具有良好的肿瘤组织的靶向性,能够使肿瘤增殖受到抑制。2,通过从酵母基因组中扩增胞嘧啶脱氨酶CD的编码基因FCY1,建立重组质粒pEGFP-N1-FCY1,与5-FC组成自杀基因系统CD/5-FC。为了对CD/5-FC系统进行评估,我们建立了一种能够同时定性定量分析细胞提取物中微量5-FC和5-FU的毛细管区带电泳的新方法,应用该方法对转染pEGFP-N1-FCY1重组质粒的293T,以及稳定表达CD-GFP融合蛋白的HCT116-FCY1细胞,在5-FC的作用下将5-FC转化为5-FU进行定性定量分析,并进一步验证5-FC作用下HCT116-FCY1细胞发生凋亡的原因。检测结果一方面证实了 CD/5-FC系统构建成功,另一方面证明了建立的细胞提取物中微量5-FC和5-FU的毛细管区带电泳检测方法的有效性,为CD/5-FC自杀基因系统相关研究提供快速简单的分析手段。3,开展自杀基因治疗的关键是获得有效的基因输送载体。因此,在以上研究工作的基础上,开展了 PEI功能化的氧化石墨烯作为CD/5-FC系统的纳米输送载体的研究。利用25 kDa支链PEI通过正负电荷相互吸引的方式结合到氧化石墨烯表面,即获得GO-PEI。通过细胞活性测定评价其生物相容性,并且考察了与质粒结合能力,体外细胞转染效率,以及体内转染效果等方面,对GO-PEI作为纳米基因输送载体进行评价。研究表明:PEI修饰的GO具有生理溶液稳定性;表面带有稳定的正电荷,能够与质粒DNA在较低的N/P条件下完全结合;在一定浓度范围或N/P条件下,GO-PEI具有良好的生物相容性和良好的细胞转染效果;但是通过尾静脉注射和瘤内注射荷瘤鼠,荧光成像和Western blot蛋白表达的分析表明合成的GO-PEI并不能通过尾静脉注射和瘤内注射两种方式对活体内的肿瘤组织进行基因输送和实现目的蛋白表达。4,为了获取有效的纳米基因输送载体,对嵌入式双介孔二氧化硅纳米球EDMSNs作为CD/5-FC自杀基因系统的纳米传输载体进行了研究。首先,利用不同量的25 kDa支链聚乙烯亚胺(PEI)对EDMSNs进行修饰,获得不同PEI负载量的EDMSNs-PEI复合物。通过考察其对细胞活性的影响,与质粒的结合能力,体外细胞转染效率,尾静脉注射和瘤内注射肿瘤组织后的转染结果,评价EDMSNs-PEI作为基因输送载体的效果。通过考察活体内抑制HCT116移植瘤的肿瘤生长状况,评价EDMSNs-PEI介导的CD/5-FC自杀基因系统的抗肿瘤效果。琼脂糖凝胶电泳实验表明EDMSNs-PEI具有良好的质粒结合能力。细胞毒性实验表明控制在一定浓度范围内EDMSNs-PEI具有良好的生物相容性。体外细胞转染确定了 EDMSNs与PEI的质量比为2时,即EDMSNs-PEI(2)转染HCT116细胞的效果最佳。尾静脉注射不能实现肿瘤组织的特异性转染,通过瘤内注射可以实现对肿瘤组织的成功转染,表明PEI修饰的EDMSNs具备肿瘤组织的基因输送的能力。最后通过瘤内注射进行了活体内抑制肿瘤生长的研究,EDMSNs-PEI/pEGFP-N1-FCY1/5-FC组能够使肿瘤增长减慢,具有良好的抑制体内肿瘤增长的效果,而且对小鼠的毒副作用较低。总之,通过我们的研究表明PEG功能化的氧化石墨烯可以作为DCM-S-PPT药物传输的纳米载体,根据肿瘤组织和微环境特点,将纳米材料的被动靶向和前药的主动靶向相结合,为实现肿瘤的有效治疗做出了有益的尝试;但是PEI功能化的氧化石墨烯作为CD/5-FC自杀基因系统的基因传输载体仅在细胞水平实现了良好的转染效果,活体水平上并没有实现预期的传输效果,未来还需要进一步的优化。对EDMSNs作为基因输送载体的研究表明PEI修饰的EDMSNs具备肿瘤组织的基因输送能力,且与CD/5-FC系统联合应用可以抑制荷鼠瘤的肿瘤增殖。这些研究工作为实现纳米材料与化疗和/或基因治疗等方式结合,开发安全,高效的肿瘤治疗策略提供了实验依据。