中药的整体性决定了它多成分、多靶点、整合调节的优势和特色。然而，正是由于中药作用的整体性、成分的复杂性、以及作用靶标和机制的不明确性，阐明中药发挥药效的活性组分及其作用靶标一直是中药研究的巨大挑战。细胞膜色谱（CellMembrane Chromatography, CMC）是将细胞膜提取后键合到固定相表面的一种生物色谱，兼有细胞膜的生物活性和色谱分离的双重特性，中药复杂体系不需要传统的提取步骤，可直接在细胞膜色谱上实现活性识别过程，这种基于多组分-多靶标亲和作用的分析技术非常适用于中药活性组分筛选，已得到广泛应用。本研究针对细胞膜色谱的制备技术、应用于中药活性组分的筛选方法以及潜在活性组分的靶标鉴定等方面开展以下研究，以期进一步改进完善细胞膜色谱技术及其应用，并为中药活性组分和靶标分析提供新策略和新方法。1.细胞膜色谱技术的系统方法学考察和柱效优化研究细胞膜色谱是一种新型的生物亲合色谱，该模型使用特定细胞膜键合于硅胶上作为色谱固定相，但是由于其使用寿命较短、稳定性较差，不同实验室制备条件不一致，一直以来影响细胞膜色谱的普及。在本章中，建立了两种全新的细胞膜色谱模型（HSC-T6细胞膜色谱和SMMC-7721细胞膜色谱），对影响细胞膜色谱的重现性和稳定性的多个方面进行了考察，确定了细胞破碎度（400W，2s，5次）、细胞用量（3.5×107个）、蛋白装柱量（1500μg装柱，300μg最佳键合量）和装柱流速（10min钟的梯度装柱程序）等一系列的标准化参数和操作规程，建立实验室SOP以确保细胞膜色谱柱的重现性。此外，使用4%多聚甲醛显著提高了柱效并延长寿命。本研究对细胞膜色谱的方法学进行了全面的考察并优化，使用了两种不同细胞膜色谱模型，并采用了一种全新的细胞膜固定剂来延长柱寿命，国内外未见报道。2.全二维细胞膜色谱分析系统的构建及其在中药活性组分筛选中的应用中心切割二维色谱广泛应用于细胞膜色谱研究，但是存在第一维信息易丢失，通量低耗时长，活性组分鉴定不准确、不全面等缺陷。本章中创新构建一种全二维（2D）细胞膜色谱体系首先应用于中药抗肿瘤活性组分的筛选，构建HepG2肝癌/CMC模型作为第一维色谱柱，利用一个自动二位十通切换阀和两个定量环，第一维流出的全部组分导入第二维整体柱和飞行时间质谱（TOFMS）进行高灵敏度的分析。在系统考察2D-HepG2肝癌/CMC/整体柱/TOFMS系统的稳定性、选择性、适用性的基础上，我们从28味具有抗肿瘤活性的中药中筛选鉴别到了4个潜在活性成分，分别是黄柏中的小檗碱和四氢巴马汀以及苦参中的苦参碱和氧化苦参碱。竞争置换实验表明这四个成分均和吉非替尼在EGFR位点上发生类似的作用。进一步研究了四种活性成分在体外对HepG2肝癌细胞的增殖抑制作用，发现用药剂量和效应存在依赖性。本研究结果表明所构建的2D-HepG2肝癌/CMC/整体柱/TOFMS系统具有速度快，灵敏度高，识别能力强等优势，1小时内就能完成一味中药膜受体结合组分的筛选和明确鉴定，与传统方法相比通量和专属性大大提升，是中药活性组分筛选的可行方法。3.正常/衰竭心肌细胞膜色谱比较分析系统的构建及其在中药附子和四逆汤活性组分分析中的应用病理状态下，细胞膜上受体的状态会发生一系列改变，影响组分与其相互作用的强弱。因此，以病理组织来源的细胞膜色谱为模型是筛选中药活性组分的理想方法，可以最大程度模拟特定病症中体内药物-受体间相互作用，从而大大提高筛选的疾病专属性。目前，尚没有开发出病理组织来源的细胞膜色谱模型，也没有可以对正常和病理的细胞膜色谱柱之间的潜在活性组分的亲和力进行可视化比较的方法。在本章中，建立一种全新的基于在线柱切换和全二维色谱/整体柱/飞行时间质谱的细胞膜色谱比较分析系统，用于平行比较中药附子和四逆汤在正常和衰竭大鼠心肌细胞膜色谱上的色谱行为。分别构建正常和病理的细胞膜色谱模型，用于从附子和四逆汤中快速筛选能够调节阿霉素所诱导的心衰的专属性先导化合物。共有16个潜在的具有相似结构的活性生物碱成分在正常和衰竭心肌细胞膜色谱柱上有保留行为。与正常心肌细胞膜柱相比，大部分组分在衰竭细胞膜色谱柱上的亲和力明显降低，只有4个组分例外，分别是：塔拉乌头胺，14-乙酰塔拉乌头胺，异叶乌头素和14-苯甲酰尼奥宁。其中塔拉乌头胺具有最高亲和力，我们对其提纯分离后用于进一步的体外药效学验证和靶标鉴定，以确证细胞膜色谱筛选的结果。我们成功表征了电压依赖性钾离子通道是塔拉乌头胺和14-乙酰塔拉乌头胺的高亲和力作用靶标之一。通过这种高通量的整体比较细胞膜色谱分析，可表征活性组分与疾病的关联性，适用于中药复杂化学体系中治疗特定疾病的专属活性组分筛选，本研究提出的理念和方法同样适用于其它生物色谱模型。4.四逆汤活性组分作用靶标群的鉴定研究针对细胞膜色谱筛选到的活性组分，其作用靶标的鉴定是一项挑战性的工作。现有靶标鉴定方法往往只适用于单个小分子，需结构修饰或标记等繁琐的处理步骤，无法适用于中药复杂体系多组分的靶标分析，从而阻碍了中药复杂机制的明确阐释。药物亲和反应靶标稳定技术（DARTS）是利用分子与靶蛋白结合使其产生的稳定效应用于靶蛋白鉴定的新技术，无需对化合物修饰，因而非常适用于中药活性组分的靶标鉴定分析。本章联用药物靶标亲和反应稳定技术-双向荧光电泳技术（DARTS-DIGE）和Label-free定量蛋白组学技术，研究四逆汤治疗心肌梗死的直接和间接蛋白生物标志物。蛋白组学实验总共在正常和心梗组织中鉴定出590个蛋白，其中四逆汤给药组和模型组相比显著上调30个，显著下调51个。运用DARTS-DIGE技术成功鉴定出11个四逆汤作用于心肌细胞的直接靶标。相关潜在靶标蛋白和组学分析结果显示，四逆汤主要通过影响琥珀酸合成反应，参与NADH的生物合成过程，促进心肌收缩，维持细胞骨架和活力，参与胶原合成反应、转醛酶反应、能量转运与代谢反应、柠檬酸合成反应、3-羟基异丁基辅酶A合成酶、乙酰辅酶A脱氢酶等反应，调节离子通道活性来发挥保护心肌细胞、治疗心肌梗死的作用。通过本课题针对中药细胞膜结合活性组分筛选方法学的深入研究，系统考察优化了细胞膜色谱制备方法学，制订了实验室SOP标准；构建新型的全二维细胞膜色谱分析系统应用于中药抗肿瘤活性组分的筛选，大大提升了通量；建立比较细胞膜色谱分析系统，创新地比较中药活性组分在正常和病理细胞膜色谱上保留行为的差异，筛选到抗心衰专属性活性组分；首次联用Label-free蛋白组学技术和DARTS技术用于中药活性组分作用靶标群的筛选，为中药复杂体系靶标鉴定提供了新方法。通过本课题的相关研究，进一步促进细胞膜色谱技术的发展，也为中药活性组分的高通量筛选以及作用靶标的有效鉴定提供一些新理念和新技术。