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铜是生物机体生命活动的必需元素,畜牧生产中由于高铜有促生长和抗菌等作用,刺激了养殖户盲目的添加高铜,剂量控制不好就会导致动物机体中毒,同时大量没有被机体吸收的铜排出体外造成环境污染。纳米氧化铜由于尺寸小、活性高、易被动物机体吸收等特点成为一种可行性的铜源。本试验通过SIEC细胞的培养,比较研究纳米氧化铜和硫酸铜对细胞铜相关蛋白表达的影响,对纳米氧化铜的代谢规律及其代替硫酸铜作为猪饲料铜源的可能性进行了探讨。将冻存的SIEC细胞解冻后常规培养,采用第5-8代细胞进行试验。培养的细胞分为正常对照组、硫酸铜组、纳米氧化铜组。硫酸铜组细胞培养液当中分别添加相同体积不同剂量的CuSO4·5H2O使其终浓度分别为5、10、20、40μg/mL CuSO4,纳米氧化铜组细胞培养液当中分别添加相同体积不同剂量的纳米氧化铜使其终浓度分别为5、10、20、40μg/mL。铜处理后细胞贴壁培养24h,采样,ELISA方法测定MT含量,比色法检测细胞CuZn-SOD活性,荧光定量PCR检测MT、CTR1、ATOX1、 CuZn-SOD、COX17基因的表达量。细胞活性的检测在铜处理细胞12h、24h、36h、48h、60h各个不同的时间段用MTT法检测。肠上皮细胞为形状不规则的单层柱状上皮细胞。MTT试验中铜处理细胞后,细胞生长表现出不同程度的抑制,其中10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL硫酸铜组影响更明显。40μg/mL纳米氧化铜和5μg/mL硫酸铜组可以显著提高CuZn-SOD活性(P<0.05),但是40μg/mL硫酸铜组比同剂量的纳米氧化铜组和对照组活性降低(P<0.05)。与对照组相比,纳米氧化铜可以促进MT含量的升高(P<0.05),与同剂量的硫酸铜组相比,10、20、40μg/mL纳米氧化铜组MT含量明显升高(P<0.05)。与对照组相比,10、20、40μg/mL纳米氧化铜和硫酸铜剂量组对CTR1基因的表达表现出抑制作用(P<0.05),同剂量(10、20、40μg/mL时添加纳米氧化铜比硫酸铜对肠上皮细胞CTR1基因抑制作用更明显(P<0.01)。20、40μg/mL硫酸铜组和40μg/mL纳米氧化铜组金属硫蛋白基因的表达量较对照组升高(P<0.05),其中10μg/mL的纳米氧化铜组促进作用更明显(P<0.01)。10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL纳米氧化铜组CuZn-SOD基因的表达量比对照组和同剂量的硫酸铜组显著降低(P<0.05)；纳米氧化铜和硫酸铜可以抑制ATOX1基因的转录(P<0.01),两试验组中,5μg/mL铜添加剂量时硫酸铜组ATOX1基因表达量较低(P<0.01)。添加纳米氧化铜和硫酸铜对肠上皮细胞COX17基因表达量没有显著影响(P>0.05)。硫酸铜在培养基中以铜离子形式存在,离子形式的铜进入猪肠上皮细胞主要是经CTR1转运蛋白的携带。与硫酸铜相比,纳米氧化铜在培养基中除了以离子形式存在外,还以纳米粒子的形式存在,由于纳米粒子的活性高可以通过细胞膜进入细胞,对转运蛋白的依赖性较低导致猪肠上皮细胞基底侧的CTR1蛋白转录水平降低。进入肠上皮细胞后的铜一条途径是与MT结合形成螯合物,由于纳米氧化铜以两种途径进入细胞,导致铜流失减少,细胞内铜含量比硫酸铜组高,引起MT转录水平的表达量升高。进入细胞的铜需要适量的抗氧化酶拮抗铜对细胞的氧化作用,与硫酸铜组相比,纳米氧化铜组更能有效地激活细胞内的抗氧化系统,表现为：进入细胞的铜除提高细胞中CuZn-SOD的活性外,在5μg/mL时通过促进ATOX1表达,促进铜离子代谢出细胞；在10、20、40μg/mL时激活细胞内的谷胱甘肽途径,形成对细胞的有效保护机制。MTT试验可以发现硫酸铜显著抑制细胞增殖的活性,而纳米氧化铜的抑制作用不明显。基于以上原因,纳米氧化铜在代替硫酸铜方面具有明显的优势。