副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,Hps)属于巴斯德菌科嗜血杆菌属,是猪上呼吸道的常在菌,在一定条件下可以突破黏膜屏障引发猪的Gl(a|¨)sser病。目前,该病的发病率和死亡率在世界范围呈显著上升趋势。众多事实表明,Hps分离株复杂多样,甚至在同一血清型中也存在较大差异,现有疫苗产生的免疫交叉保护十分有限。为了有效控制Gl(a|¨)sser病,许多国家展开对Hps地方流行株的各项生物学特征和功能研究,希望在发展诊断技术的同时,能更多地从分子水平发掘相关毒力因子,阐明其致病机理。但目前能应用于Hps的分子生物学研究手段还比较有限,对基因的发掘和功能研究有待进一步深入。抑制差减杂交技术(Suppression subtractive hybridization,SSH)作为比较基因组的一种方法,可以用来鉴定不同株细菌之间基因组差异及基因表达差异,以其高效便捷和假阳性低得到广泛应用。Hps在中国最为流行的为血清5型与血清4型,其中5型SH0165株与4型MD0322己被用作疫苗菌株。本研究采用SSH技术对这两株菌进行基因组差异片段的比较,鉴定SH0165特有的基因片段,试图通过差异比较,发掘出一些与入侵及致病相关因素。主要工作包括:1抑制差减杂交分别提取SH0165株、MD0322株基因组DNA,AluⅠ酶切12小时。以SH0165株基因组片段作为Tester,MD0322株作为Driver,进行接头连接、连接效率检测、两轮消减杂交和两轮PCR,并通过PCR检测16SrRNA消减前后的丰度,来检测消减效率。将抑制PCR及巢式PCR之后得到的消减PCR产物,经2%琼脂糖凝胶电泳,呈现出100—2000bp紧密条带,其带型明显不同于未消减的PCR产物,符合消减要求。2差减文库的构建及斑点杂交将套式PCR产物纯化后连入pMD19-T,转化DH5α感受态细胞,于AIX平皿培养。得到数千白色菌落,从中随机挑取300个克隆,利用通用引物进行菌落PCR扩增。地高辛分别标记基因组DNA酶切产物作为探针,对菌落PCR产物进行斑点杂交,得到22个阳性克隆子。3序列测定及生物信息学分析将测序鉴定,阳性克隆子中DNA插入片段的大小为189—988bp,G+C含量为28.4%-49.6%。对测序结果采用Blastn与Blastx程序在NCBI中进行同源性分析。有8个片段与NCBI中已知功能的相关序列同源,依据推测的功能,这些序列主要与Hps的生化代谢、DNA损伤修复、膜蛋白合成及应激反应有关。有5个片段与目前功能未知的假想蛋白同源。9个片段与噬菌体相关蛋白同源。4特异性片段在标准株及分离株中出现频率检测采用PCR,鉴定除噬菌体相关基因以外,其余13个片段在Hps15个标准株中的出现频率,发现有5个片段(HC14,HC16,HC36,HC84,HB156)的出现预示着一些偏向性。将这些片段继续在45株地方分离株中进行检测,发现片段HC14与HC16在高、中毒株出现频率均高于低毒株。这两个基因都与细菌在不利环境中的自身调节有关,并且都位于基因组中可转移原件,推测它们在Hps菌株中发生了水平转移,导致菌株之间生活力的差异。5荧光定量PCR初步验证HC36与HC16基因的功能HC36经生物信息学分析和查阅文献,推断它的表达受铁离子调控。采用吡啶诱导缺铁环境,培养细菌并提取其RNA,荧光定量PCR鉴定基因表达与铁离子的关系。结果表明,在缺铁诱导后30、60、90min,,该基因的转录量分别是正常情况下的3.1、4.0和2.4倍(P＜0.05)。由于Hps在入侵机体时,通常要克服体内缺铁环境,所以推断该基因可能与增强菌株的环境适应性、提高在体内的生活力有关。HC16片段推测为毒素.抗毒素稳定系统(toxin-antitoxin stability(TA)system)的抗毒素(antitoxin)元素。采用SHT诱导了氨基酸饥饿条件,在此条件下培养SH0165株,采用荧光定量PCR技术探究HC16基因的转录水平。结果表明,在诱导60min后,其mRNA量已是未诱导组的2.6倍(P＜0.05)。这说明氨基酸饥饿较迅速诱导了HC16基因基因启动子的转录。由此初步推测HC16这个TA loci,有可能与氨基酸饥饿应激有关。6 HC16基因过量表达对菌体生长的影响将单独的Toxin基因以及Toxin-Antitoxin全基因分别克隆进表达载体pET-28a,在大肠杆菌BL21中诱导表达。结果显示,含pET-28a-toxin质粒的菌体与含空质粒pET-28a的菌体在IPTG诱导后,出现同样的生长抑制,含toxin-antitoxin全基因质粒(pET-28a-TA)的菌体,在诱导后,虽然生长也受到抑制,但受抑制程度要比前两种菌体要小。IPTG对于工程菌的自身生长繁殖,是一个外界不利条件。由此提出假设,Hps的这对TA系统的表达,可能与增强细菌在逆境中的适应性和竞争力有关,然而这一假设还需要更多的研究加以验证。