由于创伤、肿瘤及退行性变等各种原因导致的关节软骨损伤在临床上常见,然而由于软骨细胞属于终末分化细胞,软骨本身缺乏血管营养等原因导致软骨组织很难自身修复,从而容易导致关节功能障碍乃至骨关节炎的发生；目前临床上修复关节软骨损伤常用的方法如关节腔清理术、关节磨削成形术、软骨下骨钻孔术及微骨折术等均存在一定不足,而白体或异体软骨细胞移植也存在来源受限及不同程度免疫排斥等问题；比较而言,软骨组织工程无疑是最有发展前景的前沿技术。本课题通过研究人脐带沃顿胶组织来源间充质干细胞的分离培养及扩增探讨新型组织工程种子细胞来源；并对骨髓及脐带来源干细胞的成软骨定向诱导分化能力进行比较研究,从而优化选择软骨组织工程种子细胞。制备新型壳聚糖/P(LLA-CL)软骨组织工程多孔支架,根据组织工程的基本原理体外构建组织工程软骨,以期为软骨组织工程的深入研究和发展提供一定的理论依据和实验基础。第一章人脐带间充质干细胞的分离、培养及生物学特性研究目的研究人脐带沃顿胶来源间充质干细胞的分离、培养并对其进行鉴定,对其生物学特性进行初步研究,为组织工程种子细胞研究提供实验基础。方法无菌获取胎儿脐带沃顿胶组织,采用混合酶消化法获取细胞。加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中进行原代培养；待细胞生长至80～90%融合时,1：3传代培养。倒置显微镜观察细胞生长形态变化,流式细胞仪检测传3代脐带干细胞细胞周期及表面抗原标志,采用MTT法测定第3、5、7代脐带间充质干细胞增殖能力,通过定向诱导检测脐带干细胞多向分化潜能。结果原代培养后12小时即可见少量细胞贴壁,24～48小时后大量细胞贴壁,细胞呈短梭形、梭形及多角形；细胞培养4～5天即进入生长对数期,开始以集落方式生长,细胞呈均一的成纤维样细胞形态；8～10天单层细胞融合接近80%,呈漩涡样生长。传代后细胞贴壁和增殖速度均明显加快,2小时左右即可见细胞贴壁,多数为成纤维细胞,细胞呈平行排列生长或旋涡状生长。流式细胞术分析显示,第3代脐带间充质干细胞超过80%的细胞处于G0/G1期(81.13%),表明细胞具有较强的增殖潜能。流式细胞仪检测传3代脐带干细胞表达CD13、 CD29、CD44、CD105,不表达造血细胞表型CD45、HLA-DR和内皮细胞特征性表型CD31; MTT法检测结果表明第3、5、7代脐带干细胞均有较强的体外增殖能力；经体外定向诱导脐带间充质干细胞可成功向成骨细胞及脂肪细胞分化。结论采用混合酶消化法可成功分离培养人脐带沃顿胶来源干细胞,经检测符合间充质干细胞基本生物学特性,是软骨组织工程良好的种子细胞来源。第二章人脐带与骨髓来源间充质干细胞成软骨特性比较目的脐带和骨髓来源间充质干细胞均具有多向分化潜能,观察人脐带沃顿胶来源间充质干细胞体外诱导分化为软骨细胞特性及相关基因表达,比较其与骨髓来源间充质干细胞成软骨分化能力的差异,从而优化选择软骨组织工程种子细胞。方法采用混合酶消化法从足月胎儿脐带沃顿胶组织分离培养间充质干细胞,取第3代脐带干细胞和平行培养的第3代骨髓间充质干细胞,均以2×105/cm2的密度接种后用条件培养基诱导其成软骨分化；脐带及骨髓对照组均采用普通培养基,不添加任何诱导因子。倒置显微镜下观察细胞生长和形态变化；诱导14天后通过甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组化染色比较观察细胞内蛋白聚糖和Ⅱ型胶原着色情况；采用RT-PCR技术检测细胞成软骨诱导过程中Sox-9、 CoL2a1及aggrecan mRNA基因表达差异。结果脐带间充质干细胞在成软骨诱导后细胞形态由长梭形逐渐变为短梭形或多角形,细胞逐渐聚集；诱导14天后脐带及骨髓MSC诱导组甲苯胺蓝染色均呈阳性,前者胞浆胞膜异染明显呈强阳性反应；脐带MSC对照组染色为淡蓝色呈弱阳性,异染细胞数量较少,而骨髓MSC对照组细胞无异染呈阴性；Ⅱ型胶原免疫组化染色脐带及骨髓MSC诱导组细胞基质均有棕黄色着色,前者异染明显呈强阳性反应；脐带MSC对照组细胞胞浆内散在淡棕色,而骨髓MSC对照组染色无异染呈阴性；RT-PCR检测结果显示脐带MSC不加诱导情况下弱表达Sox-9、CoL2a1及aggrecan mRNA,诱导后基因表达加强(P<0.05)；骨髓MSC对照组无表达,诱导后呈阳性反应；脐带MSC诱导组基因表达显著强于骨髓MSC诱导组(P<0.05)。结论脐带和骨髓来源间充质干细胞体外经定向诱导均可向软骨细胞分化,前者成软骨能力更强；脐带干细胞在不加诱导情况下有自发成软骨分化倾向；与骨髓间充质干细胞相比脐带干细胞可能更适合于软骨组织工程。第三章壳聚糖/P(LLA-CL)多孔泡沫支架的制备及生物相容性研究目的制备新型生物材料壳聚糖/P(LLA-CL)多孔泡沫支架并对其理化性质及生物相容性进行检测,探讨其作为软骨组织工程支架材料的可能性。方法制备壳聚糖/P(LLA-CL)多孔泡沫支架,对支架行扫描电镜观察,测定支架孔径、孔隙率及吸水率；分离培养第3代脐带间充质干细胞,将其与壳聚糖/P(LLA-CL)支架复合后诱导培养为实验组,单纯P(LLA-CL)聚合物支架为对照组。倒置显微镜观察细胞在支架上粘附及生长增殖情况,HE染色显示细胞在支架内部分布状况；于接种后4、8、12、24h取样采用细胞计数法测定细胞黏附率；分别于1、3、5、7d取样采用MTT法分析复合支架对细胞增殖的影响；复合培养1周及2周时取材行扫描电镜观察细胞在材料表面的生长增殖以及基质分泌情况；行裸鼠皮下包埋实验检测支架组织相容性。结果制备的壳聚糖/P(LLA-CL)支架为多孔泡沫状圆柱体结构,支架表面孔隙较多；扫描电镜显示支架孔隙分布均匀,材料内空隙相互连通；支架孔径为(183.56±16.78)um；孔隙率为(91.56±1.27)%；吸水率为(218.66%±1.55)%。支架材料接种细胞悬液后,细胞在支架表面及空隙内均匀扩散,HE染色显示壳聚糖/P(LLA-CL)支架内细胞大量存在,沿孔道均匀分布,对照组支架内细胞数量较少；MTT法显示两种支架均对细胞生长无抑制作用,实验组壳聚糖复合支架对细胞增殖有一定促进作用；细胞计数结果显示随时间延长两组材料上细胞黏附率逐渐增高,各时间点实验组支架细胞黏附率均显著高于对照组(P<0.05)；细胞-支架复合培养1周及2周时扫描电镜观察细胞在壳聚糖/P(LLA-CL)支架上均匀分布,细胞密集生长,基质分泌旺盛；对照组细胞分泌基质较少。裸鼠皮下包埋实验结果显示P(LLA-CL)复合壳聚糖后有效降低了支架炎性反应程度,组织相容性良好。结论壳聚糖/P(LLA-CL)多孔泡沫支架具备合适的孔径及孔隙率,生物相容性良好,可作为软骨组织工程良好的细胞载体。第四章脐带干细胞复合壳聚糖/P (LLA-CL)支架体外构建组织工程软骨目的探讨脐带干细胞复合壳聚糖/P(LLA-CL)多孔泡沫支架体外初步构建组织工程软骨的可能性。方法分离培养第3代脐带间充质干细胞,将脐带干细胞与预处理的壳聚糖/P(LLA-CL)多孔泡沫支架复合培养；实验分为诱导组及对照组,细胞根据分组不同分别加入成软骨诱导培养基和普通培养基进行培养。复合培养3周后取出细胞支架复合物,将复合物切片进行HE染色、甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组化染色；RT-PCR检测各组复合物培养7,14,21天表达Sox-9、CoL2a1及aggrecan mRNA的情况；Western-blot检测Ⅱ型胶原蛋白及aggrecan蛋白表达；结果细胞-材料复合诱导后随着时间延长复合物表面逐渐光滑有色泽,质地较柔韧,有类软骨样组织形成,而对照组复合物体积略皱缩,光泽较差；体外诱导培养3周实验组HE染色可见陷窝样结构,有软骨样基质形成；对照组则未见陷窝样结构,细胞分泌基质较少；甲苯胺蓝染色可见诱导组细胞及细胞外基质蓝色异染明显呈强阳性反应,对照组染色为淡蓝色,异染不明显呈弱阳性反应；Ⅱ型胶原免疫组化染色显示诱导组大量细胞内外均有棕黄色着色呈强阳性反应,而对照组无明显棕黄色；RT-PCR检测结果显示实验组随着诱导时间延长Sox-9、CoL2a1及aggrecan mRNA表达逐渐增强,而对照组各基因表达水平无明显变化,各时间点诱导组和对照组mRNA表达水平两两比较均有统计学差异(P<0.05)；Western-blot显示实验组复合物CoL2a1及aggrecan蛋白随着诱导时间延长表达逐渐增强,而对照组蛋白表达无明显变化,各时间点诱导组和对照组蛋白表达水平两两比较均有统计学差异(P<0.05)；结论脐带间充质干细胞复合壳聚糖/P(LLA-CL)多孔泡沫支架经体外诱导可初步构建组织工程软骨,为软骨损伤修复奠定了一定的实验基础。