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近年来,我国水体富营养化程度加深,致使“蓝藻水华”事件频繁出现,对人类的生产和生活造成严重的影响。为有效治理“蓝藻水华”,迫切需要寻找一种高效、高选择性且环境友好的新型杀藻剂。本实验室前期研究中,以蓝藻果糖-1,6-二磷酸/景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶(Fructose-1,6-biphosphatase/sedoheptulose-1,7-bisphosphatase,Cy-FBP/SBPase)为靶标,得到了一种对 Cy-FBP/SBPase 有较强抑制作用的化合物HQ7(IC50=1.1±0.2 μM),并通过修饰改造得到了 HQ系列化合物。本论文在此基础之上,运用DOX方法初步建立化合物HQ7与Cy-FBP/SBPase的结合模式,并基于此结合模式对HQ系列化合物与Cy-FBP/SBPase间的相互作用进行分析,建立起配体HQ系列化合物与受体Cy-FBP/SBPase相互作用的模型。然后在此基础上建立基于受体结构的新的药效团筛选模型,展开了靶向Cy-FBP/SBPase的新型抑制剂的筛选、修饰改造及合成的工作。具体研究内容主要包括如下几方面:1、建立配体HQ系列化合物与受体Cy-FBP/SBPase的相互作用模型:基于Cy-FBP/SBPase的晶体结构(PDB代码:3RPL),以对Cy-FBP/SBPase抑制活性较好的化合物HQ7为代表,采用DOX方法从理论上初步确立HQ7与Cy-FBP/SBPase的结合模式。该结合模式显示底物空腔中氨基酸残基ARG176、ARG178、TYR131和THR102与HQ7形成氢键作用。这与空腔氨基酸定点突变蛋白酶动力学分析结果一致,验证了 HQ7与Cy-FBP/SBPase理论结合模式的合理性。基于此结合模式,对HQ系列化合物与Cy-FBP/SBPase间的相互作用进行详细分析,此结合模式基本可以解释HQ系列化合物结构与抑制活性之间的构效关系,进一步证明了 HQ7与Cy-FBP/SBPase理论结合模式的准确性。通过以上分析,建立了配体HQ系列化合物与受体Cy-FBP/SBPase的相互作用模型。此模型主要由三部分组成:(1)由氨基酸残基ARG176、ARG178、TYR131组成的结合区域;(2)由氨基酸残基THR102和起催化作用的金属镁离子组成的催化区域;(3)由疏水性氨基酸残基VAL201、ALA222组成的疏水区域。根据以上研究,确定下一步虚拟筛选新型抑制剂的药效团为底物空腔中起到重要的作用的氨基酸残基ARG176、ARG178、TYR131、THR102。2、虚拟筛选及苗头化合物(Z18)的获得和表征:根据建立的新的药效团筛选模型,运用对接软件SYBYL-X 2.1.1中的Flex-Pharm限制性对接(限制小分子与药效团 ARG176、ARG178、TYR131、THR102 之间的相互作用)和 Surflex-Dock 非限制性对接程序,对Maybridge化合物库进行两轮虚拟筛选。共筛选得到20个苗头化合物。从speces数据库中购买并测试了化合物在终浓度为100 μM时对Cy-FBP/SBPase的抑制活性,结果显示其中有4个化合物对Cy-FBP/SBPase有较强的抑制作用,且化合物Z18对Cy-FBP/SBPase呈现最好的抑制活性,在100 μM时对Cy-FBP/SBPase的抑制率达到80%以上。3、新型抑制剂A系列化合物的获得和表征:以化合物Z18作为进一步修饰改造的先导化合物,并将其重新命名为化合物Al。结合化合物A1在Cy-FBP/SBPase底物空腔中的结合模式,对化合物A1进行修饰改造。首先将A1的叔丁基部分改造为苯环,得到化合物A2,使得抑制剂分子可以更全面的占据底物空腔。结果表明,对 Cy-FBP/SBPase 抑制活性从 IC50=14.6±0.2μM 提高到 IC50=8.9±0.3μM,抑制活性提高1.6倍。然后对A2两边苯环上的取代基进行改造,成功获得了对Cy-FBP/SBPase抑制活性更好的化合物A16,其IC50=0.3±0.1 μM,抑制活性是A2的30倍,是先导化合物A1的49倍。4、新型抑制剂A16与Cy-FBP/SBPase结合模式的研究:理论上,利用对接方法预测抑制剂A16与Cy-FBP/SBPase的结合模式。从结合模式可以看出,抑制剂A16与空腔中的氨基酸残基ARG176、ARG178、TYR131、THR102形成了氢键作用。通过定点突变及酶抑制动力学实验,分析了新型抑制剂A16对Cy-FBP/SBPase底物空腔重要氨基酸突变体的抑制作用。结果表明,抑制剂A16对Cy-FBP/SBPase底物空腔中氨基酸残基ARG176、ARG178、TYR131、THR102、ASP200的突变体的抑制作用变弱或失去抑制作用,进一步确定了抑制剂A16与Cy-FBP/SBPase的结合模式。