研究背景：烟曲霉(Aspergillus fumigatus)是一种腐生孢子,属于真菌的一种,它对环境中碳和氮原子的循环起着重要作用。自然界中,真菌种类有很多种,烟曲霉菌不是最多的一个种类,但是还是广泛分布于土壤、腐败的植物空气中。它的生殖形式是孢子生殖,因此每一个孢子都能产生数以万计的小孢子,然后释放到空气中。这些小孢子直径非常小,能够被人或动物吸入肺泡内。哺乳动物的免疫系统分为天然免疫和适应性免疫,在免疫系统正常的情况下,机体能清除被吸入的烟曲霉分生孢子,使机体免受疾病的困扰。然而,近些年来由于广谱抗生素和器官移植后免疫抑制剂的大量使用,各种严重的真菌感染(包括烟曲霉感染)人群大量增加。其中最常见的为念珠菌的感染,而已有资料表明曲霉菌的感染比例已逐渐赶超念珠菌的感染,并且曲霉菌的感染所造成症状的严重程度更甚。烟曲霉分生孢子可侵袭不同的部位,大部分病人可造成呼吸道感染,根据不同的侵袭部位,可以分为过敏性疾病和侵袭性疾病等等。最严重的就是侵袭性肺曲霉病,这是一种严重的感染,每年可造成高达50%的死亡,烟曲霉和免疫系统的相互作用与疾病密切相关。在1997年发表的《Infection and Immunity》杂志中,印度的Taruna Madan证明了存在于肺上皮中蛋白激酶D通过增加吞噬细胞摄取烟曲霉来抑制烟曲霉的感染。蛋白激酶D是一种具有三个亚型的新的丝氨酸／苏氨酸蛋白质家族,分为PKD1、PKD2、PKD3。有研究表明PKD1在高温放线菌-多孢高温多孢菌(Saccharopolyspora rectivirgula)引起的过敏性肺炎中起主要作用,并且PKD1的抑制剂对于治疗这种肺炎是一种非常有效的手段。文章表明PKD家族蛋白酶可能参与调节TLR4和TLR5影响细胞因子的分泌,在人类和脊椎动物中,TLRs家族通过MyD88分子诱导PKD1的激活。但是目前我们不知道,在天然免疫过程中烟曲霉是否能够激活PKD1,并且是否PKDl在烟曲霉诱导的炎症反应中起作用。核因子-кB ((nuclear factor-KB)是一个转录因子,可以受到细胞因子、细菌等刺激而活化,能参与调控肿瘤发生、炎症反应、天然免疫应答等等。大量的证据表明核因子-кB ((nuclear factor-KB)在天然免疫和适应性免疫中都有着不可或缺的作用。有证据表明缺乏NF-кB蛋白的小鼠的体内B细胞和T细胞的增殖与激活,B细胞和T细胞的转变,细胞因子的产生明显受到影响。另有研究证实NF-кB的抑制剂能够抑制树突状细胞的成熟,而树突状细胞是免疫应答的中心环节。正常情况下,Toll样受体可直接或间接的识别进入体内的细菌,被识别后,激活下游的信号分子MyD88,进一步导致受体蛋白TNF受体相关因子6(TRAF6)磷酸化进而激活NF-кB通路。目前PKD1在烟曲霉介导的NF-кB通路的激活及转录活性中的作用尚未见报道,因此本文旨在探讨其作用,并为下一步研究作用机制奠定基础,继而期望能够找到临床上治疗烟曲霉引起的疾病的方法。目的：本研究探讨PKD1在烟曲霉介导的NF-кB通路的激活及转录活性中的作用,为进一步阐明PKD1在烟曲霉感染引起的烟曲霉病中的作用及作用机制奠定基础。方法：首先将GFP、GFP-PKD1表达质粒分别转染人肺腺癌上皮细胞A549和HEK293细胞中,分别将灭活的烟曲霉分生孢子(1×105CFU/mL)于不同时间处理上述两组细胞,Western blot证实PKD1的过表达,并检测PKD1的磷酸化活性；其次在A549细胞中分别转染GFP-PKD1、siRNA-PKD1并以灭活的烟曲霉分生孢子处理细胞30分钟,分别检测下游NF-кB通路相关信号分子的磷酸化活性；最后,将NF-кB-1uc荧光素酶报告基因及内参照报告质粒海肾荧光素酶(pRL-SV40)共转染入表达GFP、GFP-PKD1的A549细胞中,两组细胞在有无烟曲霉分生孢子的作用下处理24小时,收集细胞裂解液,进行双色荧光素酶活性检测；过表达或干扰PKD1,在有无烟曲霉分生孢子下刺激24小时,用Trizol法提RNA,用荧光定量PCR的方法检测炎症因子IL-8、TNF-a的变化。结果：1、PKDl过表达时间依赖性的增强烟曲霉刺激的A549细胞和HEK293细胞中PKDl的磷酸化活性将外源性的GFP、GFP-PKD1转入A549中,转入24h,检测有过明显表达,然后用灭活的烟曲霉分生孢子(1×105CFU/mL)分别用不同时间处理A549,结果显示烟曲霉显著增强GFP-PKD1过表达的A549细胞中Ser744/748和Ser916位点的磷酸化活性,并且以时间依赖的方式增强PKD1上Ser744/748和Ser916位点的磷酸化活性,烟曲霉分生孢子处理30min,其PKD1上Ser744/748和Ser916位点的磷酸化活性达到稳定,60min处理明显降低,并且我们在HEK293中做同样处理,结果与A549细胞一样,表明烟曲霉确实以时间依赖的方式激活外源性表达PKD1的细胞中的磷酸化活性。2、PKD1的过表达增强烟曲霉刺激的NF-кB通路中IκB和p65(pS276)的磷酸化我们不知道PKD1是否参与了烟曲霉激活的NF-кB信号通路,所以我们检测了在过表达PKD1的A549细胞中有无烟曲霉分生孢子的刺激对于NF-кB通路激活的影响。,PKD1的过表达明显增强烟曲霉刺激的pIкB和NF-кB的p65的Ser276的磷酸化激活,而与GFP对照组相比,PKD1的过表达对Ser536的磷酸化活性没有影响。3、PKD的抑制剂GO6976降低A549细胞中烟曲霉对NF-кB通路的激活作用利用PKD的抑制剂GO6976(1μM)作用于A549细胞1小时,在有无烟曲霉的作用下刺激30min,收集细胞裂解液,用Western blot的方法检测PKD的磷酸化位点pS744/748,以及IκB的变化。结果显示,PKD1的磷酸化位点减弱,表明抑制剂有作用,IκB的增加显示抑制剂G06976降低NF-кB通路的激活作用。4、敲低PKDl的表达降低烟曲霉对NF-кB信号通路的激活作用既然PKD1的过表达可明显增强烟曲霉刺激的NF-кB信号通路的激活,是否敲低PKD1的表达能降低烟曲霉对NF-кB信号通路的激活作用?为了证实上述假设,我们利用Lipofectamine2000分别将siCTL(siRNA对照)、si-PKD1转染A549细胞中,转染24h后,血清饥饿24小时,最后两组细胞分别在有无烟曲霉分生孢子的作用下处理30分钟,收集细胞裂解液。结果表明,与对照相比,si-PKD1的转染明显降低内源性PKD1的表达。与此相一致,敲低内源性PKD1的表达,则明显降低烟曲霉刺激的A549细胞中pIкB和p65(pS276)的磷酸化活性,而对于p65蛋白的表达没有影响5、PKD1的过表达明显增加烟曲霉刺激的NF-кB的转录激活活性利用双色荧光素酶报告基因检测系统,将2x NF-кB-luc和海肾荧光素酶报告基因pRL-SV40(内对照)分别共转染入GFP、GFP-PKD1表达的A549细胞中,转染12小时后血清饥饿12小时,然后GFP、GFP-PKD1两组细胞分别进行有无烟曲霉分生孢子处理24小时,细胞裂解液分别进行双色荧光素酶活性检测,各组细胞的萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性的比值用相对荧光素酶活性(RLU)表示。与GFP对照相比,GFP-PKD1的过表达明显增加NF-кB的转录激活活性,而且也明显增加烟曲霉刺激的NF-кB的转录激活活性。6、敲低PKD1的表达可以降低烟曲霉介导的NF-кB通路下游的炎症因子的表达利用siRNA敲低PKD1的表达,应用荧光定量PCR的方法检测NF-кB通路下游的炎症因子的表达。结果表明,敲低PKD1的表达可以降低烟曲霉介导的NF-кB通路下游的炎症因子IL-8、TNF-a的表达。结论：在肺腺癌上皮细胞中,PKD1在烟曲霉刺激的NF-кB信号通路的激活及转录活性中起重要作用。PKD1的过表达能增强烟曲霉刺激的NF-кB信号通路下游蛋白的磷酸化激活,并且对P65磷酸化激活具有选择性调节。过表达PKD1明显增强烟曲霉对NF-кB通路的转录激活。敲低PKD1的表达可以使NF-кB下游炎症因子减少。PKD的抑制剂G06976可以降低烟曲霉介导的NF-кB通路的激活作用。总之,本研究结果证明PKD1介导的NF-кB信号转导途径在肺曲霉病的发病中起着重要作用。