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副溶血弧菌是一种短杆菌,革兰氏染色呈阴性,具有嗜盐性。其主要的栖息地在海水中,是近海岸常见的食源性病原菌。临床上主要通过食用被副溶血弧菌污染的生的或未熟的海产品而感染,能够引起人呕吐、腹泻、头痛、伤口感染,甚至会导致败血症。对动物主要引起水生动物疾病,例如对虾、鲍鱼、蟹类等,造成动物大量死亡。为研究副溶血弧菌二硫键氧化还原蛋白VpDsbA的氧化性和还原性,首先将编码VpDsbA蛋白的目的基因VP3054（VpdsbA1）和VPA1271（VpdsbA2）克隆至原核表达载体pET-28a上,进而转化到E.coli BL21（DE3）中,进行蛋白原核表达,并使用镍柱亲和层析的方法,纯化出VpDsbA1和VpDsbA2蛋白。利用纯化后的蛋白制备VpDsbA1和VpDsbA2多克隆抗体,为后续试验的开展奠定基础。为了进一步研究VpDsbA的体外功能,采用胰岛素作为底物测定还原酶活性的方法,确定VpDsbA具有还原酶活性,且VcDsbA>VpDsbA1>EcDsbA>VpDsbA2。利用谷胱甘肽（GSH/GSSG）处理蛋白并根据相应的公式,从而计算出VpDsbA1的氧还电位大小为-118mV,VpDsbA2的氧还电位大小为-123mV,从而反映出VpDsbA氧化性和还原性的相对强弱。由于组成VpDsbA的氨基酸中缺少色氨酸,不具有紫外吸收高峰,为了能够进一步采用光谱分析系统分析VpDsbA的氧化酶活性,通过定点突变的方法,将VpdsbA1F92W/Y143W和VpdsbA2Y92W/Y143W进行突变后的目的片段克隆至原核表达载体pET-28a上,构建了VpDsbA色氨酸突变体,进而转化到E.coli BL21（DE3）中,进行蛋白原核表达,并使用镍柱亲和层析的方法,得到VpDsbA1和VpDsbA2色氨酸突变体蛋白。以胰岛素作为底物测定VpDsbA的还原酶活性,同时进行氧还电位测定,分析数据结果得出,VpDsbA色氨酸突变体的氧化还原酶活性与野生型基本一致,因此可以将构建的VpDsbA色氨酸突变体蛋白用于替代野生型VpDsbA蛋白进行相应的酶学分析。VpdsbA基因缺失株与回补株的成功构建以及对相应的表型进行分析发现,与野生型相比,ΔVpdsbA1和ΔVpdsbA2对菌株的生长速度影响差异不大,但双缺失菌株导致生长速度稍微减慢,回补后生长状态基本恢复。采用氯化镉试验检测VpDsbA氧化酶活性,随着CdCl2浓度增加,ΔVpdsbA1和ΔVpdsbA2抵抗CdCl2的能力降低,这说明VpDsbA1和VpDsbA2在副溶血弧菌中确实起到氧化酶的功能。从神奈川试验产生β-溶血环的面积可以看出,ΔVpdsbA1和ΔVpdsbA2产生溶血环的面积减小,回补后基本恢复到野生型的水平。这些试验结果说明,VpDsbA很可能通过影响副溶血弧菌溶血素蛋白的正确折叠,从而影响其功能。综上所述,本研究通过进行VpDsbA多克隆抗体的制备、还原酶活性检测以及氧还电位的测定,确定VpDsbA蛋白的体外功能;成功构建了VpDsbA色氨酸突变体蛋白,并对其进行还原酶活性检测以及氧还电位的测定,为进一步研究VpDsbA蛋白的氧化酶活性提供实验基础。另外,对VpdsbA缺失株与回补株的成功构建以及相关表型的分析,确定副溶血弧菌的体内功能,为研究VpDsbA蛋白的致病性奠定基础。