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背景:胃癌是常见的胃肠道恶性肿瘤。在中国,胃癌发病率高居不下,在肿瘤引起的死亡原因中占据了第三位。众所周知,恶性肿瘤的生长转移与血管生成关系密切。而血管靶向治疗近些年来也得到越来越多的关注,包括贝伐单抗在内的多种血管分子靶向药被批准应用到临床中。其中在胃癌中,2014年雷莫卢单抗被FDA批准应用于晚期胃癌的治疗,成为首个应用于胃癌治疗的血管靶向药物。然而血管靶向治疗在取得丰硕成果的同时,也面临着一些亟待解决的问题,如治疗不反应,耐药以及副作用等。如何解决这些问题成为靶向血管治疗的关键。微小RNA(microRNA,miRNA)是一种细胞自身合成的小片段RNA。在肿瘤中,微小RNA的作用涉及了包括肿瘤血管生成在内的多种肿瘤恶性表型。而多靶点、特异性强等特点也使得其成为抑制肿瘤血管生成中一种潜在的治疗手段。miR-218是我们实验室首先发现在胃癌中起到了抑制转移作用的一个微小RNA,并首次鉴定了其靶基因ROBO1。有趣的是miR-218作为一个内含子微小RNA,其编码基因恰好存在于ROBO1的配体SLIT2和SLIT3中。而SLIT-ROBO家族与神经发育和血管生成关系密切。由此我们提出猜想,miR-218是否可通过其靶基因ROBO1影响胃癌血管生成呢?在本次研究中,我们首先在组织标本中明确了miR-218在血管中的表达模式。随后通过平面管腔形成实验等方法观察miR-218在体外对血管生成的影响。并进一步探索了ROBO1在其中发挥的作用。在动物实验中我们采用瘤内注射miR-218模拟物的方法,通过检测血管密度和肿瘤体积变化从而研究miR-218在体内对肿瘤血管的影响。目的:1.观察研究miR-218在胃癌组织血管和正常胃粘膜血管中的表达差异。2.通过体内外功能学实验观察miR-218对血管生成表型的调控作用。3.探索miR-218调控胃癌血管生成的潜在分子机制。方法:1.通过胃癌组织芯片原位杂交的方法,检测miR-218在胃癌组织和正常组织中的表达变化。通过免疫组织化学染色的方法,在连续芯片切片中染色CD31从而对组织中血管进行定位,并结合mi R-218原位杂交结果,比较分析miR-218在胃癌血管和正常胃上皮组织血管中的表达差异。2.通过划痕愈合实验、平面管腔形成实验、3D培养下内皮细胞出芽实验检测miR-218对内皮细胞血管生成表型的影响。3.通过qRT-PCR、western blot验证miR-218在血管内皮细胞中对ROBO1的靶向调控作用。4.构建ROBO1稳定过表达的慢病毒并感染内皮细胞,通过Transwell迁移实验,平面管腔形成实验观察ROBO1在miR-218介导的胃癌血管生成中的可能作用。5.在体内,利用胃癌细胞系BGC-823构建裸鼠皮下胃癌移植瘤模型。通过瘤内分次多点注射的方法观察miR-218在体内对移植瘤生长及血管生成的影响。结果:1.原位杂交结果显示,miR-218在胃癌组织中的表达水平显著低于其相对应的癌旁正常组织。此外,结合样本的临床病理特征分析发现miR-218在胃癌中的低表达与患者的TNM分期和淋巴结转移密切相关。利用Kaplan Meier曲线进行生存分析后发现低表达miR-218的患者预后较差。2.通过CD31染色血管并对微血管密度进行计数后,发现胃癌组织中血管密度明显高于正常胃上皮组织。而进一步结合miR-218原位杂交结果分析显示,miR-218在肿瘤血管内皮中的表达明显低于正常胃粘膜中血管。3.miR-218在体外可抑制原代脐静脉内皮细胞(HUVEC)的迁移能力,在管腔形成实验中,过表达miR-218后的HUVEC形成小管的长度和节点数目都有明显降低。与此相一致的是,下调了miR-218的表达后,HUVEC的迁移能力及管腔形成能力则得到明显增强。此外在3D培养环境中,过表达mi R-218后的HUVEC出芽生长能力也受到了明显的抑制。同样,在慢病毒构建的miR-218稳定表达的永生化脐静脉内皮细胞系(HUVEC-2C)中,miR-218可负向调控内皮细胞的迁移能力和平面管腔形成能力。4.RT-qPCR以及western-blot结果证实miR-218在内皮细胞中可靶向调控ROBO1的表达。而通过小干扰RNA技术干扰了ROBO1的表达后,发现内皮细胞的迁移细胞数目明显减少,形成小管的长度和数目也低于对照组。进一步研究发现,在miR-218稳定表达的HUVEC-2C细胞中,通过携带有ROBO1编码基因的慢病毒感染的方法,实现了ROBO1表达的恢复,而Transwell和管腔形成实验均显示ROBO1可部分逆转mi R-218对血管生成的负向调控作用。以上结果表明miR-218在内皮细胞中可靶向调控ROBO1的表达,而ROBO1则介导了mi R-218抑制血管生成的作用。5.在裸鼠皮下移植瘤模型中,瘤内注射miR-218的模拟物可明显抑制移植瘤的生长速度。取出瘤块后病理切片染色显示,相比于对照组,miR-218注射组中肿瘤细胞增殖减少,而CD31标记的肿瘤微血管密度也明显低于对照组。结论:在胃癌组织样本中我们通过原位杂交的方法检测发现,mi R-218在胃癌中表达下调,并与患者不良预后密切相关。相比于正常血管,miR-218在胃癌血管中表达显著降低。在体内外功能实验中,miR-218可负向调控血管生成表型。而机制研究发现ROBO1作为mi R-218的直接靶基因,其表达在受到miR-218的调控的同时可介导miR-218抑制血管生成的作用。综上所述,本研究采用临床样本检测分析,细胞模型和动物实验相结合的方法,利用多种细胞功能学实验及分子生物学技术证实了miR-218通过ROBO1抑制胃癌血管生成的作用。我们的发现从microRNA-靶基因的角度丰富了对胃癌血管生成机制的认识,可望为抑制胃癌生成提供新的治疗靶点。