柑橘CitR2R3MYBs家族基因的克隆及初步功能分析

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MYB是植物体内成员最多、功能最广的转录因子之一,通常根据MYB家族与目标基因启动子DNA序列结合的保守结构域的数量,将其分成4类,其中R2R3MYB是最大的亚家族。对拟南芥、水稻等模式植物研究表明R2R3MYBs转录因子参与了植物多方面的生理生化过程,例如表皮细胞的分化,次生代谢物质的调控,细胞周期的控制,腋芽分生组织的形成,柱头和花药的发育以及对各种逆境的响应和防御等。但有关R2R3MYBs转录因子在柑橘上的研究却鲜有报道。随着柑橘基因组测序的完成以及数据库的建立,为进一步开展柑橘R2R3MYB转录因子的全基因组分析提供了良好条件。  ‘资阳’香橙(Citrus junos‘ziyang’)因其高抗碱性、抗病和优质丰产等优良特性,已成为柑橘,特别是杂柑栽培的常用作砧木。本文参考柑橘基因组信息,以‘资阳’香橙为材料,鉴定了R2R3MYBs基因的数量及其在基因组上的分布,并结合聚类分析和实时荧光定量PCR技术对其进行表达谱分析,最终筛选鉴定一个与抗盐相关的R2R3MYB基因,并对其进行了克隆、过表达载体构建和转化烟草初探其功能。该研究旨在为利用基因工程技术改进柑橘品种抗逆性提供重要的功能基因,不仅具有重要的理论意义,还具有潜在的重要生产应用价值。主要研究结果如下:  1.本研究利用拟南芥R2R3MYB氨基酸序列,在柑橘数据库查找所有的MYB数据,然后利用PROSITE和SMART软件分析这些MYB的特征结构域,并在柑橘(Citrus sinesis和Citrus clementina)基因组上鉴定了101个R2R3MYB基因,其数量几乎与水稻中R2R3MYB基因的数量是几乎相等的。通过构建进化树可以把这101个R2R3MYB基因分成21个亚族。分析其进化关系和外显子-内含子的结构特征,显示R2R3MYB基因具有高度保守性和长期演化过程中形成的特别功能基因。半定量分析101个R2R3MYB基因在香橙根、叶片、花和幼果不同组织的特异性表达,我们发现95个R2R3MYB基因至少在一个组织中高表达,其余6个基因则在所有的被检测的组织中其表达量极低,由此推测R2R3MYB基因在柑橘组织生长发育过程中起着重要的调控作用。实时表达分析 R2R3MYB基因在多种非生物胁迫(NaCl,ABA,甲基茉莉酸,干旱和低温)下的表达丰度,结果显示多数R2R3MYB基因可响应一种或多种胁迫处理,这为提高柑橘适应非生物逆境胁迫能力的分子标记育种提供了理论基础。  2.从‘资阳’香橙中分离、克隆了一个可能参与柑橘逆境胁迫的R2R3MYB基因,即CitMYB40,其开放阅读框(ORF)为1047 bp,推测为可编码348个氨基酸残基的多肽。以CitMYB40基因组序列与cDNA比对的结果表明CitMYB40含有2个内含子,氨基酸结构分析表明CitMYB40是MYB类转录因子家族中成员数最多的R2R3MYB亚家族。通过进化树分析,CitMYB40与拟南芥参与逆境响应的R2R3MYB亚家族成员AtMYB74同源性最高,相似度达到80%,预示了CitMYB40基因也可能参与了植物渗透性胁迫。  3.为初步探究CitMYB40基因的功能,构建了p35S:CitMYB40-GFP表达载体,亚细胞定位结果显示,CitMYB40蛋白定位于细胞核中。构建CitMYB40-pBI121过表达载体,通过遗传转化W38烟草,发现转基因烟草与野生型烟草对高盐胁迫表现出明显的差异;CitMYB40基因在烟草中的过表达,也能够改变与逆境相关基因(NtCBF1、NtERD10C等)的表达,为进一步研究CitMYB40基因在柑橘组织中的抗逆功能奠定基础。  综上所述,本文基于柑橘基因组数据库,鉴定了‘资阳’香橙中101个R2R3MYB基因,对这些基因之间的进化关系、蛋白结构的保守结构域及组织特异性表达和对不同逆境胁迫的响应模式进行了初步分析,以发现它们潜在的生物学功能。基于此,克隆了一个R2R3MYB基因,CitMYB40,并转基因烟草验证其抗逆功能,结果显示,该基因的可能是通过诱导相关胁迫基因的表达参与植株的抗盐性。
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