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第一部分：TLRs介导的角膜上皮细胞对烟曲霉菌的天然免疫反应目的：研究角膜上皮细胞Toll样受体(TLR)2和TLR4分别对配体刺激的免疫反应及其介导角膜上皮细胞对烟曲霉菌炎症反应的作用。方法：培养永生化人角膜上皮细胞,利用TLR2配体酵母聚糖、TLR4配体LPS及烟曲霉菌菌丝分别刺激角膜上皮细胞,于不同时间点(1h,3h,6h,12h)收取培养上清进行酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞因子IL-1β和IL-6水平。分别设计靶向人TLR2、TLR4的siRNA序列,构建表达TLR2-或TLR4-siRNA的质粒,分别转染角膜上皮细胞,利用RT-PCR及Western blot检测TLR2、TLR4表达以评价抑制效果。利用烟曲霉菌菌丝并分别刺激转染siRNA的角膜上皮细胞及未转染对照细胞,于不同时间点(1h,3h,6h,12h)利用ELISA检测上清中细胞因子IL-1β和IL-6水平。结果：TLR2配体酵母聚糖、TLR4配体LPS及烟曲霉菌均可刺激永生化人角膜上皮细胞(THCE)分泌炎性细胞因子IL-1β和IL-6。酵母聚糖刺激角膜上皮细胞后6h IL-1β和IL-6水平开始升高,并呈时间依赖性。LPS刺激后12h可见细胞因子显著性升高,但表达水平不如酵母聚糖刺激明显。烟曲霉菌刺激后3h细胞因子水平即明显升高,随刺激时间延长进一步上调。TLR2-或TLR4-siRNA贡粒转染角膜上皮细胞后,TLR2、TLR4 mRNA及蛋白水平表达均受到显著抑制。烟曲霉菌菌丝刺激后对照组IL-1β和IL-6表达明显上调,而TLR2-或TLR4-siRNA处理组IL-1β和IL-6水平均较对照组显著降低。结论：TLR2配体和TLR4配体可诱导角膜上皮细胞的天然免疫反应；角膜上皮细胞通过TLR2和TLR4识别烟曲霉菌并介导炎性细胞因子表达。角膜上皮细胞表达的TLR2和TLR4在角膜抗真菌感染天然免疫中发挥重要作用。第二部分：TLR2介导茄病镰刀菌诱导的人角膜基质细胞抗炎细胞因子表达目的：研究TLR2在茄病镰刀菌诱导的人角膜基质细胞促炎细胞因子和抗炎细胞因子表达中的作用。方法：设计靶向人TLR2 siRNA序列,连接入p-silencer 2.0 U6载体构建能表达TLR2-siRNA的质粒。分别转染永生化人角膜基质细胞,利用免疫荧光、RT-PCR及Western blot检测TLR2的表达。制备茄病镰刀菌菌丝和孢子刺激液并分别刺激转染siRNA的角膜基质细胞及未转染对照细胞,刺激12h后利用实时荧光定量PCR检测细胞因子IL-1β和IL-10的表达。结果：TLR2-siRNA质粒转染人角膜基质细胞后,TLR2 mRNA及蛋白水平表达均明显被抑制,mRNA抑制效率为60%,蛋白抑制效率可达65%左右。对照siRNA转染组、空载体组及空白对照组TLR2表达无显著差异。单纯镰刀菌菌丝和孢子均可刺激人角膜基质细胞IL-10和IL-1β表达明显上调,与对照组有显著差异(P<0.01),其中菌丝刺激组细胞因子表达水平比孢子刺激组高。分别使用茄病镰刀菌菌丝及孢子刺激后,对照组IL-1β及IL-10的表达均明显上调,且菌丝诱导的表达上调比孢子更显著；RNA干扰组,IL-10表达较对照组明显降低,菌丝刺激组IL-10表达下调82%,孢子刺激组下调70%,与未干扰组表达水平比较均具有显著差异(P<O.01)；IL-1β的表达亦有降低,菌丝刺激组下调60%,孢子刺激组约下调54%,具有统计学差异,但不如IL-10下调显著。结论：TLR2是人角膜基质细胞识别茄病镰刀菌的重要识别受体,它可能通过介导IL-10的表达发挥一种抗炎性作用。这将为探索角膜真菌感染发病机理和免疫防御反应机制提供新的思路。第三部分：RNA干扰大鼠角膜TLR2表达对角膜真菌感染的影响目的：研究RNA干扰大鼠角膜TLR2对角膜烟曲霉菌感染的影响。方法：分别合成对照siRNA或TLR2siRNA,与转染试剂混合制备siRNA悬液,于感染前1天给予结膜下注射联合表面点眼。利用角膜接触镜法建立大鼠烟曲霉菌性角膜炎模型,进行裂隙灯检查、临床评分及组织病理学分析评价感染情况。利用免疫荧光技术检测大鼠角膜TLR2表达以评价TLR2 siRNA转染的效率。利用实时定量PCR技术检测炎性细胞因子TNFa, IL-1β, IL-4, IL-6, IL12p40和趋化因子MCP-1和MIP-2表达水平。利用髓过氧化物酶(MPO)法检测多型核白细胞(PMN)浸润。结果：TLR2 siRNA转染后,大鼠角膜TLR2表达明显减少,呈区域性、节段性分布。对照siRNA转染组角膜TLR2呈正常表达。对照组大鼠角膜给予烟曲霉菌接种后,角膜炎呈进行性发展,第1天可见角膜上皮呈毛玻璃样水肿,第3天可见明显的黄白色溃疡,边界不清,角膜缘充血明显；病变发展迅速,第4-5天为感染高峰期,溃疡面进一步扩大,表面凹凸不平,角膜中央区坏死组织脱落呈典型的龛状溃疡,可见后弹力层膨出、角膜葡萄肿甚至角膜穿孔。转染组感染后第1天角膜见轻度炎性浸润,第3天角膜浸润较前加重,但未见明显溃疡,第5天浸润开始减轻,面积逐渐局限、缩小,于2周左右完全愈合,仅存小片云翳及新生血管。对照组大鼠角膜炎性细胞因子TNFa, IL-1β, IL-4, IL-6, IL12p40及趋化因子MCP-1、MIP-2表达水平在第1天开始上调,于3-5天达到高峰,第7天开始下降并于2周后恢复至低水平。相比之下,TLR2 siRNA转染组炎性细胞因子TNFa, IL-1β, IL-6, IL12p40及趋化因子MCP-1、MIP-2水平明显降低,IL-4水平未见显著下调。TLR2 siRNA转染组PMN浸润较对照组明显减轻。结论：siRNA可通过结膜下注射联合点眼的方式成功转入角膜组织。TLR2是角膜识别烟曲霉菌感染的主要受体,在诱导炎性细胞因子产生和炎性浸润发挥关键作用。TLR2siRNA可通过下调炎性细胞因子及炎性细胞浸润达到抑制角膜过度炎症反应和减少角膜损伤的目的,为探索利用TLR2基因沉寂治疗角膜真菌感染的新方法提供了理论依据。