牛支原体是影响肉牛和奶牛养殖业的一种重要病原,主要导致肺炎,乳腺炎和关节炎等。抗生素对牛支原体病的治疗效果较差,且耐药性产生迅速。市场上商用化灭活疫苗免疫保护力较低,弱毒疫苗可望提供更好的保护效果,但目前尚无可用的商业化牛支原体弱毒疫苗。牛支原体的致病机制和诱导的机体免疫反应不清楚是阻碍疫苗研发的重要因素。本研究通过比较牛支原体强弱菌株接种后牛体临床症状、大体和组织病理学变化、器官带菌情况、体液免疫反应、细胞免疫反应、细胞因子水平、外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)转录组学及组织中关键因子的表达等,对牛支原体引起的机体应答反应进行了比较研究,以期全面揭示牛支原体的致病机制和免疫机制。主要研究内容如下:1.牛支原体强弱菌株动物感染模型的建立将20头断奶奶公犊分为4组,P1组滴鼻感染牛支原体野生株(n=6),P150-ND组滴鼻感染致弱菌株P150株(n=6),P150-HI组皮下注射接种P150株(n=4),阴性对照组用PPLO滴鼻(NC组,n=4)。临床症状观察发现:牛支原体P1能够刺激犊牛产生较为严重的呼吸道症状,直肠体温升高;P150-ND组犊牛接种后没有出现显著的临床症状;P150-HI组犊牛接种后应激反应较大。P1株导致犊牛出现较为严重的肺脏病变,入侵并定植于呼吸道组织,还能入侵肺门淋巴结、脾脏、肾脏等器官,鼻腔排菌在22d以上;P150-ND与P150-HI组犊牛无显著的大体和肺脏病变,组织中没有分离到牛支原体,鼻腔排菌时间小于18d。2.牛支原体强弱菌株及不同接种途径对犊牛体液免疫的影响测定犊牛感染后的抗体水平,结果表明,牛支原体强弱菌株鼻黏膜感染后均能够诱导血清中各种抗体的产生,以Ig G和Ig A为主,其中P150株感染犊牛28d后血清中的Ig G2水平显著高于P1组(p<0.05);牛支原体强弱菌株均能诱导唾液中一过性的Ig A和Ig M;P1组犊牛鼻腔灌洗液中的Ig A显著增加(p<0.05);与P150-ND组相比,P150-HI组犊牛的血清各抗体水平,唾液中Ig A水平均较低(p<0.05)。3.牛支原体强弱菌株及不同接种途径对犊牛细胞免疫的影响各感染组感染后第14d PBMC的增殖指数均高于NC组(p<0.05)。P1感染犊牛后第14d和21d PBMC的总凋亡细胞显著高于P150-ND组,活细胞数比例显著低于P150-ND组(p<0.05)。P150-ND组犊牛PBMC中CD4+细胞比例显著高于P1组和NC组(p<0.05);P1组犊牛CD4+/CD8+细胞比率显著低于NC组(7d,p<0.05)。这表明,P1株能诱导机体PBMC的凋亡,而P150株黏膜接种能够引起机体较强的CD4+细胞分化。利用蛋白芯片进一步检测了犊牛感染后7d和14d全血刺激后上清中细胞因子的水平。结果显示,P1组MIG、TNF-α、IFN-γ、IL-13水平显著低于NC组(p<0.05),表明牛支原体强毒株感染动物后,血液某些促炎因子的分泌受到抑制;P150-ND组除IL1F5的表达水平显著高于NC组(p<0.05)外,其IFN-γ、IL-1α、IL1F5、TNF-α、MIG和IP10的表达水平显著高于P1组(p<0.05);P150-HI组在接种后第7天全血上清中的IL-1α和GASP1水平显著低于P150-ND组。4.牛支原体强弱菌株感染犊牛后外周血单个核细胞转录组表达谱的研究分析牛支原体强弱菌株感染犊牛后第7d PBMC的转录谱,结果发现:与NC组相比,P1组单独上调和下调的基因分别为874和519个;P150组单独上调和下调的基因分别为540和274个。GO功能分析发现强毒株P1单独上调的基因主要富集在炎性反应、凋亡过程和RNA调节过程等生物学过程。KEGG pathway分析发现这些基因涉及bacterial invasion of epithelial cells和Fc gamma R-mediated phagocytosis等通路;P1单独下调的基因主要富集在氧化还原过程、细胞黏附I-κB激酶的调控等生物学过程,涉及的KEGG pathway主要为ABC transporters和NFk B信号。进一步分析发现,上调基因SYK,TP53,IL-6,STAT3,ATP5B,GSK3B,ACTG1及下调基因UBC,TNF,TLR4,INS,HSPA8,NFKBIA,INSR,NOS3和BIRC3是P1调控宿主反应的重要差异表达基因。其中,大部分上调基因涉及Th17细胞分化,SYK和UBC是强毒株调节机体应答反应的关键基因,可能参与强毒菌株P1对机体的免疫抑制。弱毒株P150组单独上调的基因主要富集在信号转导、细胞增殖与分裂、蛋白质泛素化和SUMO样降解及基因组核苷酸的修复等生物学过程;KEGG pathway分析发现这些基因涉及nucleotide excision repair和ubiquitin mediated proteolysis等通路;P150单独下调的基因主要富集在细胞黏附、ATP合成的调控及K48相关的蛋白去泛素化等生物学过程,机体果糖和甘露糖的代谢通路可能受到了影响。UBE2I,RAD23B,GTF2H4,SOCS1,MDM2,TCEB1,CDK7,ITCH,UBE2D3,UBE2E3和RCHY1可能在P150对机体的免疫保护中起重要作用。这些基因大部分为泛素化相关酶,功能涉及Th1,Th2及Th17反应的调控,其余涉及核苷酸的剪切修复。将171个随菌株毒力增加基因表达梯度增加的基因进行分析,发现这些基因主要涉及RNA的过程调控及血小板的激活功能,inflammatory mediator regulation of TRP channels和bacterial invasion of epithelial cells可能参与了牛支原体诱导的机体免疫反应调控。TRPV4、CALM和ITPR1可能是参与这些梯度变化的重要基因。牛支原体强毒株P1诱导机体肺脏发生的损伤可能与TRPV4参与的TRP通道有关,CALM和ITPR1可能也参与了这种损伤调节。5.牛支原体强弱菌株调节宿主反应重要差异基因的验证将分析得到的重要差异基因与犊牛平均日增重和病理变化评分进行相关性分析,发现18个基因和9个基因与大体评分和肺脏评分分别呈显著正相关和负相关(p<0.05),另外1个基因和两个基因与大体评分显著正相关与负相关(p<0.05);1个基因和4个基因与平均日增重显著正相关和负相关(p<0.05)。其中,IFN-γ与病理变化评分显著负相关(p<0.05),与平均日增重显著相关(p<0.05);IL-17D与病理变化评分显著相关(p<0.05)。对犊牛感染强毒菌株后PBMC和肺组织中涉及Th17细胞分化通路中关键因子的表达水平进行验证。结果表明,P1组PBMC中IL-23R和IL-21R,肺组织中IL-6、IL-23R和IL-21R的m RNA表达水平高于其他两组(p<0.05);P1组肺组织中IL-6和IL-21R的蛋白水平显著上升(p<0.05)。P1组犊牛全血上清中的IL-17A水平在感染后第14d显著高于NC组和P150组(p<0.05)。综合分析后,推测P1株感染犊牛后可能使机体产生致病性的Th17反应,这种反应是Teff17细胞分化上调和Treg细胞分化抑制的综合结果,与牛支原体造成的病理损伤相关。P150组全血上清中的IFN-γ水平在感染后第7d显著高于NC组和P150组(p<0.05),表明候选疫苗P150株促进机体的Th1反应。综上所述,牛支原体强弱菌株诱导的机体应答反应差异主要体现在细胞免疫上方面。强毒株P1诱导机体PBMC的早期凋亡,抑制机体炎性因子如IFN-γ和TNF-α的分泌和相关基因如TNF,TLR等的表达,从而逃避宿主的免疫识别和清除,入侵并定植在机体多个组织;P1通过上调犊牛PBMC中Th17细胞分化相关基因,增强致病性Teff17反应,抑制Treg17反应,从而促进IL-17A的分泌,这种反应可能与牛支原体导致的肺脏病变相关;SYK和UBC是P1影响机体反应应答的关键基因;P1诱导的机体肺脏损伤可能与TRPV4介导的TRP通道有关。致弱菌株P150诱导机体PBMC中CD4+细胞比例的增加,促进Th1反应,使机体产生较高水平的细胞因子如IFN-γ,快速产生免疫应答,这些应答反应的调节可能与蛋白的泛素化调节和核苷酸的修复有关。另外,牛支原体强弱毒株均能诱导机体产生体液免疫,以血清Ig G和Ig A的水平增加为主,弱毒株组犊牛在接种后28d的血清Ig G2水平高于强毒株组,强毒株P1可引起鼻腔灌洗液中Ig A水平升高。本研究更新了对牛支原体发病机理和免疫机制的理解,为有效防控牛支原体相关疾病的措施提供基础依据与支持。