[背景与目的]肺癌是全球范围内恶性肿瘤发病、致死的首位原因,是男性中发病率第一、女性中第二的恶性肿瘤(仅次于乳腺癌),其5年生存率仍较差,低于15%。近年研究显示,DNA中仅有2%左右的序列可以编码蛋白质,约70%～90%的序列为非编码序列,这些序列通过积极的转录得到非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)。ncRNA中数量最多的一种是长度大于200nt的长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)。LncRNA编码大分子蛋白质的能力有限,但其可通过影响染色质重构、DNA转录、mRNA稳定性、mRNA转录加工及翻译等过程,发挥复杂的调控功能,参与疾病的发生发展。LncRNA功能多样,数量众多,越来越多的lncRNA分子被发现与恶性肿瘤的生物学行为相关。lncRNA CASC9(cancer susceptibility 9)于2015年首次在食管鳞癌中被报道,之后相继于肝癌、胃癌、乳腺癌等疾病的研究中被证实具有类癌基因的功能。CASC9关于肺癌的研究还很有限,有研究发现EGFR-TKI耐药肺癌细胞株PC9G中CASC9高表达,敲低CASC9可恢复细胞对药物的敏感性。而CASC9在NSCLC中的生物学功能和作用机制方面,尚无广泛被认可的理论形成,有待更深入的研究。本研究第1章应用生物信息学工具,对NSCLC中的差异表达基因进行筛选,接着将CASC9与其他差异表达基因做共表达分析和功能富集分析,寻找可能与CASC9功能机制相关的信息。第2章在60例NSCLC患者的组织样本中测定CASC9的表达水平,并分析其表达与临床病理学特征的相关性。第3章在体外细胞层面探究了CASC9对A549、H1299,及SK-MES-1细胞的生物学行为影响。第4章通过Western-Blot、qPCR、CCK8,以及克隆形成实验,研究了 CASC9可能的分子机制。第5章应用裸鼠移植瘤模型再次验证了 CASC9在NSCLC中的生物学功能。本课题为深入研究CASC9在NSCLC中的作用提供了一些工作基础及依据。[方 法](1)NSCLC的差异表达基因及与CASC9关系的生物信息学分析:提取TCGA数据库肺鳞癌(LUSC)、肺腺癌(LUAD)样本,应用R语言软件对肿瘤和对照组间进行差异表达分析,绘制NSCLC差异表达基因热图;应用R语言软件以及生信在线工具验证CASC9在LUSC、LUAD中的差异表达,绘制散点图;应用METASCAPE对CASC9差异共表达基因进行功能富集、信号通路富集分析。(2)NSCLC临床组织样本及相关信息收集:收集2018年3月1日至2019年2月15日期间初诊于我院胸外二科符合纳入标准的患者共60例(鳞癌23例,腺癌37例),采取肿瘤组织及远端肺正常组织(距肿瘤边缘>5cm),保存组织于RNAlater,置于-80℃;(3)细胞系培养:Beas-2B、SK-MES-1用含 10%FBS 的 DMEM 培养基,A549、SPC-A1、H1299、GLC 用含 10%FBS 的1640培养基,置于37℃,5%CO2浓度的培养箱培养。(4)总RNA提取及qRT-PCR检测:研磨组织、细胞沉淀用Trizol法提取总RNA,控制RNA样品OD260/280比值在1.8～2.1之间,琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性;应用SYBR试剂,2△-△△Ct相对定量法,检测并计算CASC9的表达水平。(5)siRNA瞬时转染:应用siRNA与Lipofectamine 3000、OTPI减血清培养基对细胞进行转染。(6)细胞增殖实验:CCK-8法:瞬转完成后,细胞接种至96孔板,分别于培养后24h、48h、72h、96h测定每孔OD值;克隆形成实验:细胞接种于六孔板,培养14天后进行细胞固定、结晶紫染色。(7)细胞迁移、侵袭实验:应用Transwell培养小室(孔径8μm),上室接种细胞,不含血清,下室含血清,培养24小时后收细胞,进行固定、染色。(8)细胞周期检测:应用碘化丙啶染色法,检测488nm处红色荧光,分析细胞周期分布情况。(9)细胞凋亡检测:应用Annex in V-FITC双染法检测凋亡细胞。(10)Western Blot检测蛋白表达:应用SDS-PAGE法对MMP9、CD44、p53、p21、CDK2、c-Myc,及 GAPDH 蛋白进行半定量检测。(11)回复实验:敲低CASC9的同时抑制p21,观察对A549细胞增殖能力的影响。(12)裸鼠成瘤实验:构建A549稳转细胞系,在裸鼠行异种移植瘤实验,记录裸鼠体重、瘤体积等信息,35天后处死裸鼠,称量瘤重,取瘤组织保存,行相关指标检测。第1章NSCLC差异表达基因与IncRNA CASC9的生物信息学分析[结 果](1)在 NSCLC 中,有 864 个差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)在肺鳞癌表达(612个上调,252个下调),782个DEGs在肺腺癌差异表达(488个上调,294个下调)。两种类型中143个DEGs相同(上调基因113个相同,下调基因30个相同)。(2)与正常肺组织相比,CASC9在肺鳞癌和肺腺癌中分别升高约2.36倍和1.66倍。(3)GEPIA分析提示,CASC9在Ⅳ期患者中的水平明显高于Ⅰ～Ⅲ期(p=0.0257)。(4)CASC9的差异共表达基因在肺鳞癌中有412个(323个正相关,89个负相关),肺腺癌中有204个(147个正相关,57个负相关)。(5)富集分析结果提示,肺鳞癌中有尼古丁成瘾信号通路(hsa05033)以及细胞分化负调控的功能(GO:0045596)可能与CASC9在NSCLC中的功能相关;肺腺癌中有细胞衰老相关信号通路(R-HSA-2559586)、基因沉默的负调节(GO:0060969),以及细胞外基质黏附(GO:0007160)可能与CASC9在NSCLC中的功能相关。[结论](1)NSCLC中存在数量众多的差异表达基因,其表达谱在NSCLC不同病理类型间既有差异,也有共同点。(2)CASC9在肺鳞癌和肺腺癌中表达均明显升高,且与肺鳞癌患者的TNM分期为Ⅳ期明显相关,提示CASC9可能与NSCLC患者的远处转移和预后相关。(3)CASC9在NSCLC不同病理类型中发挥作用的机制可能存在差异,其在肺腺癌中的功能可能与细胞衰老信号通路高度相关。第2章LncRNA CASC9在NSCLC中的表达及临床意义[结果](1)CASC9在肿瘤组织中高表达:NSCLC肿瘤组织中CASC9高于肺正常组织(tumor vs.normal:ACt:14.01±0.44 vs.10.38±0.37;p<0.001)。同样的趋势见于肺腺癌(LUAD:tumor vs.normal:ACT:12.31±0.62 vs.10.43±0.66;p=0.034)及肺鳞癌(LUSC:tumor vs.normal:ACT:16.18±0.47 vs.10.33±0.31;p<0.001)。(2)ROC曲线提示CASC9对区分NSCLC的癌与非癌组织具有良好的诊断效能:NSCLC:AUC(95%CI):0.734(0.669-0.799);肺腺癌:AUC(95%CI):0.612(0.515-0.710);肺鳞癌:AUC(95%CI):0.929(0.886-0.973)。(3)在60例组织样本中(鳞癌23例,腺癌37例),CASC9与临床病理特征相关:卡方检验法:CASC9的异常高表达与病理为肺鳞癌(p=0.009)、更晚的分期(Ⅱ～Ⅳ)(p=0.017)、来自非肺癌高发地(p=0.007)明显相关;T检验法:CASC9 表达水平在Ⅱ～Ⅳ期患者(Ⅰ vs.Ⅱ～Ⅳ:ACt:11.32±0.71 vs.9.51±0.36;p=0.0178),以及来自非肺癌高发地的患者(low incidence area vs.high incidence area:△Ct:9.41±0.38 vs.12.09±0.78;p<0.001)中表达更高。(4)CASC9在肺鳞癌中的表达高于肺腺癌(LUSC vs.LUAD:10.47±7.10 vs.3.67±4.95;p<0.001)。[结论](1)CASC9在NSCLC肿瘤组织中高表达,ROC曲线AUC结果提示其可能具有潜在的诊断价值。(2)CASC9高表达与病理类型、TNM分期、患者来源地相关,提示其可能与NSCLC患者的疾病进展或预后相关。(3)CASC9与NSCLC的患者来源地相关的发现尚属首次,其可能在不同人群中具有不同的功能或作用机制。(4)CASC9在肺鳞癌中表达高于肺腺癌,CASC9在NSCLC的不同病理类型中可能存在功能或机制方面的差异。第3章LncRNA CASC9在NSCLC细胞系中的生物学功能研究[结果](1)CASC9 在 NSCLC 细胞系 A549、H1299、SK-MES-1、GLC、SPC-A1 细胞中的表达较肺正常上皮细胞Beas-2B高表达,差异显著。(2)敲低CASC9抑制A549、H1299,以及SK-MES-1细胞的增殖、迁移,及侵袭能力。CCK-8实验:敲低CASC9抑制NSCLC细胞增殖,A549细胞效果在第2～4天(p<0.05;p<0.01;p<0.01)较显著;H1299细胞效果在第4天较显著(p<0.05);SK-MES-1 细胞效果在第 2～4 天(p<0.001;p<0.001;p<0.01)较显著。克隆形成实验:敲低CASC9显著抑制A549(p<0.01)及H1299(p<0.05)细胞的克隆形成能力。Transwell实验:抑制CASC9显著降低A549、H1299,及SK-MES-1 细胞的迁移能力(p<0.001;p<0.001;p<0.01)和侵袭能力(p<0.001;p<0.01;p<0.01)。(3)敲低CASC9将NSCLC细胞周期阻滞于G1/G0期:G1/G0期比例分别为:A549-NC vs.A549-SH1:63.17%±6.12%vs.74.92±5.41%,p<0.01;H1299-NC vs.H1299-SH1:70.88%±2.24%vs.75.78±1.88%,p<0.01;SK-MES-1-NC vs.SK-MES-1-SH1:57.32%±0.18%vs.63.79±1.02%,p<0.01。(4)敲低CASC9对NSCLC细胞凋亡的影响不显著。[结论]CASC9在多株NSCLC中异常高表达。敲低CASC9抑制NSCLC细胞的恶性表型,并导致细胞周期阻滞于G0/G1期。结果提示CASC9在NSCLC中发挥促癌作用机制。第4章LncRNA CASC9影响NSCLC发生发展的分子机制研究[结果](1)p53/p21/CDK2轴是细胞衰老信号通路R-HSA-2559586的关键作用点,敲低CASC9可以上调p53及p21的表达,继而抑制CDK2的表达。(2)回复实验结果显示,敲降CASC9的同时抑制p21的表达,可使A549细胞中CDK2表达重新上升,细胞增殖活性也有所回复。(3)c-Myc需通过CDK2发挥促进增殖作用,研究中敲低CASC9可明显下调c-Myc、CDK2 的表达。(4)CD44是MMP9的直接靶点,研究中抑制CASC9可下调MMP9、CD44的表达。[结论](1)CASC9在NSCLC中的作用机制可能与影响p53/p21/CDK2轴,干扰细胞衰老相关信号通路R-HSA-2559586有关。(2)CASC9的类癌基因功能可能与上调c-Myc/CDK2轴的相关分子表达有关。(3)CASC9促进NSCLC细胞迁移、侵袭的作用可能与上调MMP9/CD44轴相关分子表达相关。第5章LncRNA CASC9影响NSCLC增殖的体内研究[结果](1)三组小鼠体重间未见明显差异,接种第17天以后,A549组及A549-NC组瘤体增大明显,第6周时瘤体增大最明显,与此同时A549-SH1组的肿瘤增大缓慢。(2)35天后处死裸鼠,整理所有数据,瘤体称重记录,进行数据统计。结果显示,CASC9敲低组小鼠瘤重明显小于NC组(A549-NC vs.A549-SH1:0.259±0.059 vs.0.083±0.013,p<0.01)和空白组(A549 vs.A549-SH1:0.267±0.040vs.0.083±0.013,p<0.001)。[结论]敲低CASC9可抑制NSCLC细胞的体内增殖成瘤活性,其具有促癌基因的功能,该结论与体外细胞实验层面一致。