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一、研究目的近年来的研究表明，长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）与肿瘤发生发展密切相关，影响肿瘤细胞生长、凋亡、浸润和转移。lncRNA通过多种机制发挥生物学功能，可能在转录水平、转录后水平和翻译水平等层面影响基因表达调控。由于lncRNA种类和功能的多样性，致使其生物学功能的阐明并非易事。鉴于胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，本论文以胃癌作为研究对象，采用多种生物化学与分子生物学实验技术，希望说明以竞争性内源RNA（competing endogenousRNA，ceRNA）角色影响胃癌发生是lncRNA的生物学功能之一。二、实验方法1.先通过lncRNA芯片筛选胃癌组织和癌旁组织中差异表达的lncRNA；然后使用miRcode软件和TarBase数据库预测一些主要lncRNA和肿瘤相关mRNA之间共享的miRNA。2.为验证lncRNA芯片结果，以表达水平差异最大的lncRNA—FER1L4为研究对象，采用荧光定量逆转录-聚合酶链反应（quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，qRT-PCR）检测胃癌组织及对应癌旁组织、正常胃黏膜上皮细胞株GES-1和胃癌细胞株AGS、MGC-803、SGC-7901中FER1L4的表达水平。3.双萤光素酶报告基因实验证明FER1L4是否为miR-106a-5p的靶标之一。4. miR-106a-5p类似物（mimic）转染GES-1、AGS、MGC-803和SGC-7901细胞，qRT-PCR检测miR-106a-5p靶标FER1L4和PTEN mRNA的水平。5.设计并合成针对FER1L4的小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA），然后转染至GES-1、AGS、MGC-803和SGC-7901细胞中，qRT-PCR检测FER1L4、miR-106a-5p、PTEN mRNA的水平变化，蛋白质印迹（Western blot）检测PTEN蛋白水平变化。6. FER1L4沉默后，分别采用流式细胞仪（flow cytometer）和实时细胞分析仪（Real-Time CellAnalyzer，RTCA）检测细胞周期和细胞增殖的变化。三、实验结果1. lncRNA芯片结果表明，在胃癌组织和癌旁组织中表达差异3倍以上的lncRNA有53种；结合生物信息学技术构建了胃癌相关ceRNA（lncRNA-miRNA-mRNA）网络图。2.使用qRT-PCR技术检测大样本量胃癌组织和3株胃癌细胞株中FER1L4的表达水平，证实它在胃癌组织和胃癌细胞株中均呈现低表达。3.双萤光素酶报告基因实验表明，FER1L4与miR-106a-5p间存在直接相互作用，前者为后者的靶标之一。4.转染miR-106a-5p类似物后，FER1L4和PTEN mRNA在GES-1、AGS、MGC-803和SGC-7901细胞中的表达水平均降低。5. siRNA-FER1L4在有效沉默GES-1、AGS、MGC-803和SGC-7901细胞中FER1L4表达的同时，上调miR-106a-5p的水平，在mRNA和蛋白质水平下调PTEN表达。6.机制分析发现，下调FER1L4导致细胞增殖加快的原因是促进细胞从G0/G1期进入S期。四、结论在胃癌组织和胃癌细胞株中均低表达的FER1L4是致癌性miRNA—miR-106a-5p的靶标之一。在正常胃黏膜上皮细胞株GES-1和胃癌细胞株AGS、MGC-803、SGC-7901中，当下调FER1L4表达水平时，将导致miR-106a-5p的水平上调和它的另一靶标PTEN mRNA的下调。总之，FER1L4发挥抑癌作用的可能机制之一是以ceRNA角色调控抑癌基因PTEN的表达。