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海马神经元的发育主要包括神经元生长锥、神经元突起的生长、树突棘和功能性突触的形成等重要的生物学过程。其中神经元生长锥、树突和突触生长发育与学习记忆能力息息相关,这些过程可以受到多种因素的影响。最新研究表明,石墨烯由于其良好的导电性和大比表面积可以促进细胞突起的增长,而负载贵金属的石墨烯复合纳米材料不仅保持石墨烯生物安全性,优异的电学、光学、力学特性以及极大的比表面积等优势外,还赋予了其许多新的特性,例如催化性能和增强型的光热效应等。然而,国内外尚未见基于负载贵金属的还原氧化石墨烯复合纳米材料应用于神经元细胞的相关报道,故本研究选取被赋予钯元素催化加氢能力的负载钯还原氧化石墨烯纳米复合纳米材料作为海马神经元的生长基板,针对海马神经元的细胞活性、生长锥和神经元突起,探索rGO@Pd(Reduced Graphene Oxide@Palladium)复合纳米材料对海马神经元发育的作用影响,并初步探索相关机制,探究负载贵金属的石墨烯复合纳米材料在海马神经元发育的影响作用,为促进神经元的生长发育或治疗神经元发育相关疾病提供新思路,同时也为临床工作提供实验依据,以下是我的工作:研究目的:观察不同浓度的rGO(Reduced Graphene Oxide)和rGO@Pd(Reduced Graphene Oxide@Palladium)复合纳米材料对小鼠海马神经元细胞发育的影响,并尝试对其相关机制做初步研究。研究方法:(1)取胚胎期第18天的C57BL/6胎鼠的海马组织进行原代海马神经元培养,分别用PDL包被空白对照组、不同浓度(0.01,0.02,0.05和0.1 mg/mL)的rGO组和不同浓度(0.01,0.02,0.05和0.1 mg/mL)的rGO@Pd复合纳米材料组;(2)取培养4天的海马神经元,用微管相关蛋白-2(Microtubule-Associated Protein-2,MAP-2)和酸性纤维蛋白(Glial Gibrillary Acidic Protein,GFAP)两种抗体通过细胞免疫荧光方法对细胞进行纯度鉴定;(3)取培养14天海马神经元通过脂质体转染(Green Fluorescent Protein,GFP)观察到树突棘发育状态;取培养21天的海马神经元,通过兴奋性神经元突触前膜突触素(Synaptophysin,SYP)和突触后膜突触后致密物(Postsynaptic Density Protein-95,PSD-95)两种抗体进行细胞免疫荧光方法观察海马神经元的突触成熟度;(4)超声处理rGO@Pd粉末得到rGO@Pd复合纳米材料,利用透射电镜表征(Transmission Electron Microscopy,TEM)、扫描电镜表征(Scanning Electron Microscopy,SEM)、Zeta电位图和傅氏转换红外线光谱分析(Fourier Transform Infrared Spectroscopy,FTIR)对rGO@Pd复合纳米材料进行表征;(5)分别通过CCK-8和Calcein-AM/PI检测试剂盒检测对照组和实验组神经元的细胞活性;(6)用TRITC-Phalloidin和β-Tubulin对神经元生长锥进行免疫细胞化学染色并进行统计分析;(7)用β-Tubulin抗体对神经元突起的生长长度及分支节点数进行免疫细胞化学染色并进行统计分析。研究结果:(1)神经元培养至第4天,显微镜下可观察到细胞透亮饱满、背景干净,无细胞碎片;(2)行神经元特异性标志物MAP-2细胞免疫荧光鉴定,MAP-2阳性率超过90%;(3)通过脂质体转染GFP观察到培养14天的海马神经元有不同发育阶段的树突棘形态;通过突触染色可以观察到培养21天的海马神经元已经发育成高分化的轴突和树突,建立树突棘并形成突触联系;(4)rGO@Pd复合纳米材料的纳米表征图表明,实验所用的rGO@Pd复合纳米材料纳米表面均匀,可以清晰地看到钯纳米颗粒已经均匀分散到了rGO表面;在rGO@Pd复合纳米材料中,各个官能团几乎都已经消失,含氧基团全部被还原,表明该材料为rGO@Pd复合纳米材料。(5)CCK-8检测和Calcein-AM/PI结果显示:与空白对照组相比,0.02、0.05 mg/mL的rGO组以及0.02、0.05 mg/mL的rGO@Pd复合纳米材料能提高神经元的细胞活性(P<0.05),且0.05 mg/mL的rGO@Pd复合纳米材料组的细胞活性高于0.01 mg/mL的rGO组的细胞活性(P<0.05);(6)通过TRITC-Phalloidin和β-Tubulin免疫细胞化学染色结果显示:与对照组和rGO组相比,rGO@Pd复合纳米材料上培养的海马神经元的生长锥面积显著提高(P<0.01和P<0.05);(7)用β-Tubulin免疫细胞化学染色神经元突起结果显示:0.05 mg/mL的rGO@Pd复合纳米材料组和0.05 mg/mL rGO纳米材料组海马神经元的神经元突起长度高于对照组(P<0.01和P<0.05),且0.05 mg/mL的rGO@Pd复合纳米材料组海马神经元的神经元突起长度高于0.05 mg/mL rGO组(P<0.05)。结论:(1)我们建立了一套良好、稳定、高效且纯度较高的海马神经元培养方法;(2)rGO@Pd复合纳米材料作为体外培养小鼠海马神经元的生长基板可以提高海马神经元的活细胞数量,促进小鼠海马神经元生长锥的生长以及神经元突起的伸长。