论文部分内容阅读
本文旨在从湖南省安仁县固态酒药中筛选异常毕赤酵母（Pichia anonmala）,对其生化特性、最适培养条件及安全性评价进行研究,并探究日粮添加异常毕赤酵母对断奶仔猪生长与健康的影响及其机制。本研究内容分为以下三个试验。试验一:通过传统分类学和分子生物学方法从固态酒药中筛选异常毕赤酵母,并测定其粗蛋白质、氨基酸含量、嗜杀活性,优化其培养条件。结果表明:（1）分离得到1株高蛋白菌株,经26S rDNA基因序列测定被鉴定为异常毕赤酵母（Pichia anomala）,命名为AR2016。（2）菌株AR2016粗蛋白质含量为59.56%,含有17种氨基酸,其最佳培养条件为:初始pH 5.0,生长温度28oC,转速180 r/min。试验二:通过测定异常毕赤酵母耐热、耐胆盐、耐胃肠液能力评价其有效性。为了评价异常毕赤酵母安全性,先选择20只昆明小鼠,随机分为2组（每组10只）,雌雄各占1/2。按最大灌胃容量20 mL/kg进行7 d经口毒性试验,对照组灌喂生理盐水,试验组灌喂2×109 cfu/mL异常毕赤酵母菌液;再选择40只昆明小鼠,随机分为4组（每组10只）,雌雄各占1/2,进行28 d经口毒性试验,对照组灌喂生理盐水,3个试验组（低、中、高剂量组）分别灌喂2×107、2×108、2×109 cfu/mL异常毕赤酵母菌液。结果表明:（1）抗逆性试验中,异常毕赤酵母在45oC条件下处理0.5 h后,存活率为88.90%;在0.5%高胆盐环境下异常毕赤酵母仍能存活;在人工肠液中异常毕赤酵母6.0、8.0、10 h活菌数量明显高于0 h（P<0..05）,且活菌数随着时间增加而增加。（2）与对照组相比,供试小鼠无明显中毒现象,未出现死亡,属“无毒”级（MTD>20 g/kg）,高剂量组血清干扰素-γ含量明显升高（P<0.05）。试验三:选取30头7.48±0.22 kg健康的荣昌三元（（长白×大白）×荣昌猪）28日龄断奶仔猪,随机分为3个组:对照组饲喂基础日粮（CK组）,产朊假丝酵母组（口服1×109 cfu/mL C.utilis）（C.utilis组）,异常毕赤酵母组（口服1×109 cfu/mL P.anomala）（P.anomala组）,剂量为1 mL/次/只,每个组10个重复,每个重复1头猪,试验期为28 d。结果表明:（1）与CK组相比,日粮添加C.utilis和P.anomala能显著提高仔猪末重、平均日增重和平均日采食量,降低腹泻率（P<0.05）,添加P.anomala效果优于C.utilis（P<0.05）。（2）C.utilis组和P.anomala组仔猪血清中葡萄糖、总蛋白含量以及总超氧化物歧化酶活性、谷胱甘肽过氧化物酶活性、总抗氧化能力均显著高于CK组（P<0.05）,而谷草转氨酶活性、谷丙转氨酶活性、丙二醛含量、D-乳酸含量、内毒素含量均明显低于CK组（P<0.05）。（3）C.utilis组和P.anomala组空肠内容物胰蛋白酶活性、淀粉酶活性和脂肪酶活性显著高于CK组,回肠胰蛋白酶活性和脂肪酶活性显著高于CK组。（4）P.anomala组仔猪回肠绒毛高度、绒毛高度/隐窝深度（V/C）显著高于C.utilis组和CK组（P<0.05）。（5）与CK组相比,C.utilis组和P.anomala组仔猪回肠黏膜紧密连接蛋白Occludin、Zonula occluens-1（ZO-1）蛋白相对表达量显著提高（P<0.05）,P.anomala组略优于C.utilis组（P<0.05）。（6）添加C.utilis和P.anomala能显著提高仔猪空肠和回肠黏膜基因ALP、TNF-αmRNA相对表达量;与CK组相比,P.anomala组空肠黏膜基因TLR-2 mRNA相对表达量显著升高,回肠黏膜基因APN mRNA相对表达量显著降低（P<0.05）。（7）在门水平上断奶仔猪盲肠微生物厚壁菌门相对丰度差异不显著（P>0.05）;P.anomala组拟杆菌门和放线菌门相对丰度显著升高,而变形菌门相对丰度显著降低（P<0.05）;C.utilis组放线菌门相对丰度显著提高（P<0.05）。在科水平上,P.anomala组琥珀酸弧菌科、乳酸杆菌科和毛螺菌科相对丰度显著提高（P<0.05）,弯曲杆菌科、梭菌科和弧菌科相对丰度明显降低（P<0.05）;C.utilis组毛螺菌科和乳酸杆菌科相对丰度显著提高（P<0.05）,梭菌科和弧菌科相对丰度显著降低（P<0.05）。在属水平上,P.anomala组和C.utilis组普雷沃氏菌属相对丰度显著提高（P<0.05）,芽胞杆菌属和假诺卡氏菌属相对丰度明显降低（P<0.05）。综上所述,异常毕赤酵母AR2016菌株耐热、耐猪胆盐、耐人工胃肠液,无毒、安全性较高。日粮添加C.utilis和P.anomala能显著提高断奶仔猪生产性能和消化酶活性,降低腹泻率,增强肠道屏障功能,改善肠道微生物区系,添加P.anomala优于C.utilis。