第一部分手内肌萎缩速度快于上肢大肌肉的大鼠模型建立目的在分娩性臂丛麻痹的临床病例中,神经修复手术对于手内肌的效果远不及上臂大肌肉。失神经肌肉发生不可逆萎缩后,即使神经再生非常成功,也难以恢复形态和收缩功能。在分娩性臂丛麻痹临床诊治的证据表明,手内肌进入的不可逆萎缩速度要远大于上肢大肌肉,这提示手内肌失神经肌萎缩过程中的自我调节机制可能不同于肱二头肌。本部分实验的目的是建立临床上失神经后手内肌萎缩速度快于上肢大肌肉的大鼠模型,以阐明两种肌肉对手术时机敏感性不同的形态学基础,为进一步基因研究提供理想的动物模型。方法将64只新生大鼠模拟临床上分娩性臂丛麻痹的常见类型建立模型——C5C6断裂和C7C8T1撕脱,并将其平均分为重建组和对照组。对于重建组,在神经损伤术后1、5、10、15周后分别取8只大鼠行尺神经和肌皮神经的修复手术,依次分为R1、R5、R10、R15亚组,对大鼠行神经移植修复术：C6→尺神经,C5→肌皮神经方式修复神经,并且使用2股腓肠神经移植,于术后12周取材分析。而在对照组,则在神经损伤术后1、5、10、15周后分别取8只大鼠直接取材分析,依次分为C1、C5、C10、C15亚组。之后对大鼠进行1)神经传导研究：对重建组大鼠,分别暴露两侧肌皮神经和尺神经以及前肢相应的待检肱二头肌和爪内肌,记录两侧潜伏期及诱发肌电位的波幅。2)有髓神经纤维计数：将饲养12周后的32只实验组大鼠进行有髓神经纤维计数分析：取双侧腕部为尺神经取材点,肱二头肌入肌点处为肌皮神经取材点,通过图像分析软件计算有髓神经轴突的数量。3)肌肉组织形态学分析：每只大鼠的双侧肱二头肌和爪内肌均在手术操作显微镜下取出,均行HE染色,Masson三色染色和TUNEL染色,分别用以观察肌肉萎缩,纤维增生和凋亡的情况。利用图像分析软件,测量肌纤维的平均截面积,并与左侧肌肉的该数值进行比较并计算肌细胞截面积恢复率。每张Masson染色切片统计胶原纤维截面积比。凋亡指数是予以分析样本中凋亡的肌细胞核占所有细胞核数量的比例,利用TUNEL细胞凋亡原位检测法标记切片中的凋亡肌细胞核,每张切片在20倍物镜下连续观察3-5个视野,数至1000个细胞核中凋亡细胞核所占的比例即为凋亡指数(AI,%)。每组数据根据分布以中位数(四分位区间)或均值±标准差的形式表示。采用Mann-Whitney U test来分析组间差异,所有值的概率都为双尾,统计学差异设定为0.05。结果R1、R5亚组中,尺神经和肌皮神经的复合肌肉动作电位均能测出。R10亚组中,肌皮神经仍可测出复合肌肉动作电位,而尺神经已无法测出。尺神经和肌皮神经在R15亚组内均无法测出复合动作电位。在重建组中,大鼠右侧上肢尺神经有髓神经纤维数与上左侧正常尺神经纤维数的比值的最小值在R1亚组内为85%,R5为70%,R10为73%,R15为53%；对于肌皮神经,最小比值在R1亚组内为79%,R5为66%,R10为62%,R15为67%。R1亚组前肢爪内肌的肌纤维截面积恢复率明显优于C1亚组,但R5、R10、R15亚组的恢复率与各自的对照组C5、C10、C15亚组之间的差异无统计学意义。对于肱二头肌,R1、R5、R10亚组的肌纤维截面积恢复率明显优于C1、C5、C10亚组,R15和C15的恢复率差异无统计学意义。前肢爪内肌的截面积胶原比在R1亚组小于C1亚组,R5、R10、R15各亚组却与各自的对照组间的差异无统计学意义。R1,R5亚组的肱二头肌截面积胶原比与C1、C5亚组的差异有显著统计学意义,而R10、R15和C10、C15的恢复率的差异却无统计学意义。R1和R5亚组的前肢爪内肌凋亡指数分别低于C1和C5亚组,但R10、R15却与各自对照组C10、C15亚组的差异无统计学意义。对于肱二头肌,凋亡指数在R1、R5、R10亚组分别低于C1、C5、C10亚组,但R15和C15之间无明显差异。凋亡指数呈在早期上升而到后期又下降的一种变化趋势。结论本实验证实了大鼠的产瘫模型适用于研究临床上手内肌进入不可逆萎缩速度大于上肢大肌肉这一现象。第二部分应用基因芯片技术筛选大鼠前肢爪内肌和肱二头肌在失神经肌萎缩过程中的差异表达基因目的尽管目前临床周围神经损伤后的形态修复已经几乎达到完美程度,但是神经功能修复的疗效仍然不理想：公认恢复不佳的主要原因之一,是失神经肌肉在再生神经到达之前,已经发生不可逆萎缩。但临床上手内肌和上臂大肌肉失神经后存在的两种截然不同的萎缩进程却提示,肌肉中也可能存在影响萎缩速度的因素。骨骼肌肉萎缩的过程中无论是从时间还是空间上,都存在炎症、凋亡和重建、再生的反复交替的过程,而且都是一个或多个基因群协同作用的结果。基因表达谱芯片可以大规模检测生理和各种病理条件下各基因的表达水平和变化情况,更能从全局的角度了解基因的表达情况和变化规律,为全面认识基因的功能和基因间的相互关系提供线索。本次研究的目的是利用基因芯片技术筛选大鼠前肢爪内肌和肱二头肌在失神经肌萎缩过程中的差异表达基因及相关的网络调控模式,为找到影响肌萎进程中的关键基因和通路奠定基础,从而为临床确立失神经肌萎缩进入不可逆萎缩状态的分子指标提供理论基础。方法选取64只新生7天大鼠行C5—T1全臂丛撕脱,并根据术后1、5、10、15周的时间分为4组,每组16只。在大鼠行肌肉取材前,先进行有髓神经纤维染色观察：取腕部为尺神经取材点,肱二头肌入肌点处为肌皮神经取材点,尽量选取靠近远端的完整神经组织,排除神经交叉在支配的可能。将每只大鼠双侧的前肢爪内肌和肱二头肌都取材备用。每个样本的总RNA使用NanoDrop ND-1000进行定性和定量检测,琼脂凝胶电泳检测其是否符合标准。使用Agilent微阵列芯片进行基因表达分析,按照标准方法进行的样品制备和芯片杂交。Agilent Feature Extraction software (version10.7.3.1)进行阵列图像分析。数据处理使用的GeneSpring GX vll.5.1软件(Agilent Technologies)。通过散点图、火山图筛选具有统计意义的差异表达基因。聚类分析用以分析各样本间的区别基因表达谱。应用Pathway和GO分析,以确定这些基因在整个生物过程中发挥的功能。最后,筛选出与失神经肌萎缩相关的重点通路和基因。结果我们利用基因芯片,对16组32个样本进行表达谱分析,结合生物信息学和生物统计学方法,我们筛选出了在大鼠前肢爪内肌和肱二头肌失神经萎缩后差异表达的基因；同时,我们还利用生物信息软件寻找可能参与失神经肌萎缩的生物学通路,我们鉴别出了一些重要的信号通路,它们很可能在肌纤维萎缩过程中起到了重要的作用。通过基因芯片技术对大鼠前肢爪内肌和肱二头肌的失神经肌萎缩过程进行基因表达谱分析,发现这两种肌肉在失神经后的存在大量表达基因和信号通路存在差异：例如前肢爪内肌中MLC、MHC基因,TGFβ通路中Smad系列基因高表达；肱二头肌中泛素蛋白酶通路的E1、E2s、E3s等基因高表达,MAPK通路中的NIK、SRF基因等高表达。结论大鼠前肢爪内肌失神经后,肌萎进程中自我调控的基因和信号通路较少；且主要以促进损伤、凋亡,抑制修复、再生为主。肱二头肌失神经后,肌萎进程中自我调控的基因和信号通路较多；且相较于前肢爪内肌,以促进修复、再生,抑制损伤、凋亡为主。