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第一部分间充质干细胞旁分泌肝细胞生长因子通过激活mTOR/STAT3信号通路改善肺微血管内皮细胞损伤的机制研究
目的研究间充质干细胞(Mesenchymal stem cell, MSC)旁分泌肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor, HGF)对脂多糖(Lipopolysaccharides, LPS)诱导的肺微血管内皮细胞(Pulmonary microvascular endothelial cell, PMVEC)损伤的保护机制。
方法采用Transwell小室构建MSC和PMVEC共培养体系，培养4-72h。PMVEC内加入LPS(100ng/ml)构建LPS诱导的内皮细胞损伤。给予外源性重组小鼠HGF(20ng/ml)，同时加入哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)抑制剂雷帕霉素(100nmol/L)或STAT3抑制剂(Signal transducer and activator of transcription 3, S3I-201)(100nmol/L)检测mTOR/STAT3信号通路在HGF对LPS诱导的PMVEC损伤中的作用。检测以下指标：①内皮细胞通透性：分别采用异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate, FITC)-葡聚糖法和FITC-白蛋白法检测内皮细胞旁及跨内皮细胞通透性系数；②PMVEC上清液中ET-1和vWF浓度：采用酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)法；③内皮细胞连接蛋白表达：采用免疫荧光法检测内皮细胞连接蛋白Occludin表达；④内皮细胞增殖及凋亡检测：分别采用CellCountingKit-8(CCK8)法和流式AnnexinV-FITC/PI法检测内皮细胞增殖及凋亡；⑤相关信号通路检测：采用蛋白质免疫印迹(Western blot，WB)检测p-Akt(Ser473)、Akt、p-mTOR(Ser2448)、mTOR、p-p70S6Kinase(Thr389)、p70S6Kinase、p-STAT3(Ser727)、STAT3蛋白表达。
结果①LPS损伤的肺微血管内皮细胞的建立：细胞旁通透性试验显示100ng/mlLPS较对照组明显增加PMVECs细胞旁通透性，且与LPS浓度呈正比(P＜0.05)；100ng/mlLPS作用于PMVECs后内皮损伤标志物ET-1及vWF分泌较对照组增多(P＜0.05)，呈时间依赖性(4h-24h-72h依次升高)。②MSC旁分泌HGF激活mTOR/STAT3信号通路对ARDS内皮屏障的影响：免疫荧光结果显示，与LPS组相比，MSC-PMVEC共培养组及外源性重组HGF组(20ng/ml)能增加Occludin表达。内皮细胞旁和跨细胞通透性试验显示，与LPS组相比，HGF组明显减轻PMVECs细胞旁及跨细胞通透性，且呈时间依赖性(P＜0.05)。同时外源性给予20ng/mlHGF较LPS组减少内皮损伤标志物ET-1及vWF的产生，且呈时间依赖性(P＜0.05)。WB显示，20ng/mlHGF较LPS组增加p-mTOR(Ser2448)及p-STAT3(Ser727)磷酸化水平。③mTOR信号通路在HGF修复PMVEC中的作用：免疫荧光结果显示，LPS刺激PMVEC后导致Occludin的表达减少，HGF可以增加Occludin的表达，mTOR抑制剂雷帕霉素逆转HGF的保护作用。内皮细胞旁和跨细胞通透性试验显示，HGF可以降低LPS损伤的PMVECs细胞旁及跨细胞通透性，这种保护性降低通透性作用被mTOR抑制剂雷帕霉素逆转并升高(P＜0.05)。ELISA试验显示，外源性给予HGF减少LPS刺激造成的内皮损伤标志物ET-1及vWF的产生，给予雷帕霉素后，内皮损伤标志物ET-1及vWF产生增多(P＜0.05)。WB信号通路检测显示，HGF较LPS组增加p-Akt(Ser473)、p-mTOR(Ser2448)、p-p70S6Kinase(Thr389)及p-STAT3(Ser727)磷酸化水平;给予mTOR抑制剂雷帕霉素后，蛋白磷酸化水平降低。④STAT3信号通路在HGF修复PMVEC中的作用：免疫荧光结果显示，LPS刺激PMVEC后导致Occludin表达减少，HGF可以增加Occludin的表达，STAT3抑制剂S3I-201逆转HGF的保护作用。内皮细胞旁和跨细胞通透性试验显示，HGF可以降低LPS损伤的PMVECs细胞旁及跨细胞通透性，这种保护性降低通透性作用被STAT3抑制剂S3I-201逆转并升高(P＜0.05)。ELISA试验显示，与LPS组相比，外源性给予HGF造成内皮损伤标志物ET-1及vWF减少，给予S3I-201后，内皮损伤标志物ET-1及vWF产生增多(P＜0.05)。WB信号通路检测显示，HGF较LPS组增加p-STAT3(Ser727)磷酸化水平;给予STAT3抑制剂S3I-201后，蛋白磷酸化水平降低。⑤mTOR/STAT3信号通路在HGF减轻PMVEC凋亡中的作用：LPS抑制PMVECs增殖活力，外源性重组HGF可以减轻LPS损伤的内皮细胞增殖活力(P＜0.05)；然而给予mTOR抑制剂雷帕霉素和STAT3抑制剂S3I-201阻断后，增殖作用被明显抑制(P＜0.05)。
应用AnnexinV-FITC法检测内皮细胞凋亡，结果显示，LPS明显增加PMVECs凋亡，HGF可以减轻LPS诱导的内皮细胞凋亡(P＜0.05)；给予mTOR抑制剂雷帕霉素和STAT3抑制剂S3I-201阻断后，HGF的抗凋亡的作用明显被抑制(P＜0.05)。
结论①MSC旁分泌HGF降低肺微血管内皮细胞旁和跨血管内皮细胞通透性，增加内皮细胞间接蛋白Occludin的表达，减少内皮细胞损伤标志物ET-1及vWF的表达，促进内皮细胞增殖，减少内皮细胞凋亡。②MSC旁分泌HGF通过激活mTOR/STAT3信号通路促进LPS损伤的肺微血管内皮细胞的修复。
第二部分mTORC1及mTORC2信号通路在MSC旁分泌HGF改善肺微血管内皮细胞损伤中的作用
目的研究mTORC1及mTORC2信号通路在MSC旁分泌HGF改善LPS诱导的PMVEC损伤中的作用。
方法采用Transwell小室构建MSC和PMVEC共培养体系，培养4-72h。PMVEC内加入脂多糖(LPS，100ng/ml)构建LPS诱导的损伤内皮细胞，PMVEC中加入外源性重组小鼠HGF(20ng/ml)，并构建基因干扰慢病毒介导的低表达mTORC1(Raptor)及mTORC2(Rictor)的PMVEC(PMVEC-shRaptor、PMVEC-shRictor)，检测mTORC1及mTORC2信号通路在MSC旁分泌HGF改善PMVEC损伤中的作用。同时给予AktAZD5363(1μM)检测Akt的作用。检测以下指标：①内皮细胞通透性：分别采用FITC-葡聚糖法和FITC-白蛋白法检测PMVECs细胞旁及跨内皮细胞通透性系数；②内皮细胞连接蛋白表达：采用流式检测内皮细胞连接蛋白VE-cadherin表达；③内皮细胞凋亡及增殖检测：分别采用AnnexinV-PE/7-AAD法和CCK8法检测内皮细胞凋亡及增殖；④相关信号通路检测：采用Westernblot检测p-Akt(Ser473)、Akt、Raptor、Rictor、p-mTOR(Ser2448)、mTOR蛋白表达。
结果①MSC旁分泌HGF对内皮细胞粘附连接蛋白VE-cadherin的影响：流式结果显示，与对照组比较，MSC-PMVEC共培养组及重组HGF组可以提高PMVECs的VE-cadherin表达(P＜0.05)；在信号通路的相关研究中，随着重组HGF作用时间的延长(4h-24h),mTOR、mTORC1(raptor)、mTORC2(rictor)表达逐渐增多，呈时间依赖性。②慢病毒介导的mTORC1(raptor)及mTORC2(rictor)低表达的PMVECs鉴定：采用基因干扰慢病毒介导，分别构建mTORC1(raptor)及mTORC2(rictor)低表达的PMVECs细胞株，荧光显微镜检测转染效率显示，细胞表达良好的绿色荧光信号。与干扰对照组PMVEC-GFP比较，PCR结果显示PMVEC-ShRaptor、PMVEC-ShRictor的RaptormRNA和RictormRNA表达水平明显降低(P＜0.05)。WB结果显示PMVEC-ShRaptor、PMVEC-ShRictor的Raptor蛋白和Rictor蛋白表达降低。③mTORC1(raptor)及mTORC2(rictor)对内皮细胞粘附连接蛋白VE-cadherin的影响：流式结果显示，与LPS组相比，给予外源性HGF后，内皮细胞粘附连接蛋白VE-cadherin的表达水平增高；分别给予shRaptor及shRictor下调PMVECs中raptor及rictor表达后，VE-cadherin的表达水平明显减少(P＜0.05)。④mTORC1(raptor)及mTORC2(rictor)对内皮细胞屏障的影响：流式细胞学分析显示，在给予重组HGF作用下，PMVEC-shRaptor及PMVEC-shRictor组分别较PMVEC-shRaptor-control及PMVEC-shRictor-control组相比，内皮的细胞旁及跨细胞通透性升高(P＜0.05)。WB结果显示，HGF可以提高LPS损伤的raptor及磷酸化的p-p70S6K(Thr389)蛋白，同时也提高LPS损伤的rictor及磷酸化的p-AKT(Ser473)蛋白表达；分别基因沉默mTORC1(raptor)及mTORC2(rictor)后，raptor、rictor及磷酸化的p-p70S6K(Thr389)、p-AKT(Ser473)蛋白水平降低。⑤mTORC2/Akt对内皮细胞屏障的影响：流式细胞学结果显示，阻断Rictor后，HGF刺激的VE-cadherin的减少，继续给予Akt的抑制剂AZD5363(1μM)后，VE-cadherin的表达减少(P＜0.05)。细胞通透性试验显示，与LPS+HGF共刺激组相比，shRictor(+)可以上调内皮细胞旁及跨内皮细胞通透性(P＜0.05)，Akt的抑制剂AZD5363可以继续上调内皮细胞旁及跨内皮细胞通透性(P＜0.05)。⑥mTORC1(raptor)及mTORC2(rictor)对内皮细胞凋亡的影响：细胞凋亡和增殖试验显示：外源性重组HGF可以减轻LPS损伤的内皮细胞凋亡、促进内皮细胞增殖(P＜0.05)；然而，基因沉默shRaptor及shRictor后，内皮细胞增殖作用被明显抑制、凋亡增加(P＜0.05)。凋亡蛋白Caspase-3的WB试验显示，与LPS+HGF共刺激组相比，基因沉默shRaptor及shRictor可以增加凋亡相关蛋白Cleaved-Caspase-3的表达。
结论①mTORC1及mTORC2信号通路的激活参与MSC旁分泌HGF修复LPS诱导的PMVEC损伤。②mTORC2/Akt参与MSC旁分泌HGF修复LPS诱导的PMVEC损伤。
第三部分mTOR/STAT3信号通路在HGF减轻LPS诱导的肺微血管内皮细胞线粒体依赖性凋亡中的作用
目的研究mTOR/STAT3信号通路在HGF减轻LPS诱导的PMVEC线粒体依赖性凋亡中的作用。
方法PMVEC内加入脂多糖(LPS，100ng/ml)构建LPS诱导的损伤内皮细胞，PMVEC中加入外源性重组小鼠HGF(20ng/ml)，同时加入mTOR抑制剂雷帕霉素(100nmol/L)或S3I-201抑制剂(100nm/L)检测mTOR/STAT3信号通路在HGF减轻LPS损伤的PMVEC线粒体依赖性凋亡中的作用。检测以下指标：①细胞内钙离子浓度检测：流式检测细胞内Fluo-4荧光变化；②活性氧(ROS)检测：流式DCFH-DA法检测ROS水平；③呼吸链复合物I(Complex I)表达：采用WB法检测ComplexI核心蛋白NDUFB8表达。④细胞凋亡及增殖检测：分别采用AnnexinV-FITC/PI法和CCK8法检测内皮细胞凋亡及增殖。⑤凋亡蛋白Caspase3蛋白检测：Westernblot法。⑥抗凋亡基因Bcl-2及Bcl-XLmRNA检测：逆转录-实时荧光定量聚合酶链式反应(Reverse transcription Real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)。⑦内皮连接蛋白VE-Cadherin和ZO-1检测：Westernblot法。
结果①mTOR/STAT3信号通路在HGF对内皮细胞内钙离子浓度的影响：Fluo-4荧光检测试验显示，与control相比，LPS刺激使内皮细胞内钙离子内流增加，HGF可以减少钙内流，给予mTOR抑制剂雷帕霉素及STAT3抑制剂S3I-201后，钙内流增加(P＜0.05)。②mTOR/STAT3信号通路在HGF对内皮细胞ROS的影响：流式DCFH-DA检测表明，随着HGF作用时间延长(30-60-90-120min),ROS的产生减少(P＜0.05)。同时，在30min的药物作用时间下，HGF可以减少LPS刺激产生的ROS产生；然而加入mTOR抑制剂雷帕霉素及STAT3抑制剂S3I-201后，ROS产生增多(P＜0.05)。③mTOR/STAT3信号通路在HGF对ComplexI的影响：WB结果显示，LPS可以造成ComplexI(NDUFB8)损伤，HGF可以减少LPS造成的ComplexI(NDUFB8)损伤；给予mTOR抑制剂雷帕霉素及STAT3抑制剂S3I-201后，ComplexI(NDUFB8)的表达减少(P＜0.05)。④HGF对LPS诱导的PMVEC凋亡及增殖的影响：流式AnnexinV-PE/7-AAD凋亡试验检测，随着HGF作用时间的延长(1h, 2h, 4h)，早期细胞凋亡比率降低；内皮细胞增殖试验显示，LPS可以降低内皮细胞吸光度(optical density，OD)值，给予HGF作用4h-12h-24h后，内皮细胞OD值增加(P＜0.05)。⑤mTOR/STAT3信号通路在内皮细胞凋亡蛋白中的影响：WB结果显示，LPS可以促进凋亡相关蛋白活性cleaved-caspase-3的增加，给予HGF可以减少cleaved-caspase-3的表达。mTOR抑制剂雷帕霉素及STAT3抑制剂S3I-201可以抑制凋亡蛋白的cleaved-caspase-3的表达(P＜0.05)。⑥HGF对抗凋亡基因Bcl-2mRNA及Bcl-XLmRNA的影响：RT-qPCR检测发现，与LPS组相比，HGF增加抗凋亡基因Bcl-2mRNA、Bcl-XLmRNA的表达，并且mTOR抑制剂雷帕霉素及STAT3抑制剂S3I-201可以抑制抗凋亡基因Bcl-2mRNA、Bcl-XLmRNA的表达(P＜0.05)。基因沉默mTORC1(raptor)及mTORC2(rictor)后，可抑制抗凋亡基因Bcl-2mRNA及Bcl-XLmRNA的表达(P＜0.05)。⑦HGF对内皮细胞连接蛋白VE-cadherin及Occludin的影响：WB结果显示，HGF可以增加损伤的内皮细胞连接蛋白VE-cadherin及Occludin；然而，给予mTOR抑制剂雷帕霉素及STAT3抑制剂S3I-201后，VE-cadherin及Occludin的表达水平减少。
结论mTOR/STAT3信号通路激活参与HGF减轻LPS诱导的PMVEC线粒体依赖性凋亡。
目的研究间充质干细胞(Mesenchymal stem cell, MSC)旁分泌肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor, HGF)对脂多糖(Lipopolysaccharides, LPS)诱导的肺微血管内皮细胞(Pulmonary microvascular endothelial cell, PMVEC)损伤的保护机制。
方法采用Transwell小室构建MSC和PMVEC共培养体系，培养4-72h。PMVEC内加入LPS(100ng/ml)构建LPS诱导的内皮细胞损伤。给予外源性重组小鼠HGF(20ng/ml)，同时加入哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)抑制剂雷帕霉素(100nmol/L)或STAT3抑制剂(Signal transducer and activator of transcription 3, S3I-201)(100nmol/L)检测mTOR/STAT3信号通路在HGF对LPS诱导的PMVEC损伤中的作用。检测以下指标：①内皮细胞通透性：分别采用异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate, FITC)-葡聚糖法和FITC-白蛋白法检测内皮细胞旁及跨内皮细胞通透性系数；②PMVEC上清液中ET-1和vWF浓度：采用酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)法；③内皮细胞连接蛋白表达：采用免疫荧光法检测内皮细胞连接蛋白Occludin表达；④内皮细胞增殖及凋亡检测：分别采用CellCountingKit-8(CCK8)法和流式AnnexinV-FITC/PI法检测内皮细胞增殖及凋亡；⑤相关信号通路检测：采用蛋白质免疫印迹(Western blot，WB)检测p-Akt(Ser473)、Akt、p-mTOR(Ser2448)、mTOR、p-p70S6Kinase(Thr389)、p70S6Kinase、p-STAT3(Ser727)、STAT3蛋白表达。
结果①LPS损伤的肺微血管内皮细胞的建立：细胞旁通透性试验显示100ng/mlLPS较对照组明显增加PMVECs细胞旁通透性，且与LPS浓度呈正比(P＜0.05)；100ng/mlLPS作用于PMVECs后内皮损伤标志物ET-1及vWF分泌较对照组增多(P＜0.05)，呈时间依赖性(4h-24h-72h依次升高)。②MSC旁分泌HGF激活mTOR/STAT3信号通路对ARDS内皮屏障的影响：免疫荧光结果显示，与LPS组相比，MSC-PMVEC共培养组及外源性重组HGF组(20ng/ml)能增加Occludin表达。内皮细胞旁和跨细胞通透性试验显示，与LPS组相比，HGF组明显减轻PMVECs细胞旁及跨细胞通透性，且呈时间依赖性(P＜0.05)。同时外源性给予20ng/mlHGF较LPS组减少内皮损伤标志物ET-1及vWF的产生，且呈时间依赖性(P＜0.05)。WB显示，20ng/mlHGF较LPS组增加p-mTOR(Ser2448)及p-STAT3(Ser727)磷酸化水平。③mTOR信号通路在HGF修复PMVEC中的作用：免疫荧光结果显示，LPS刺激PMVEC后导致Occludin的表达减少，HGF可以增加Occludin的表达，mTOR抑制剂雷帕霉素逆转HGF的保护作用。内皮细胞旁和跨细胞通透性试验显示，HGF可以降低LPS损伤的PMVECs细胞旁及跨细胞通透性，这种保护性降低通透性作用被mTOR抑制剂雷帕霉素逆转并升高(P＜0.05)。ELISA试验显示，外源性给予HGF减少LPS刺激造成的内皮损伤标志物ET-1及vWF的产生，给予雷帕霉素后，内皮损伤标志物ET-1及vWF产生增多(P＜0.05)。WB信号通路检测显示，HGF较LPS组增加p-Akt(Ser473)、p-mTOR(Ser2448)、p-p70S6Kinase(Thr389)及p-STAT3(Ser727)磷酸化水平;给予mTOR抑制剂雷帕霉素后，蛋白磷酸化水平降低。④STAT3信号通路在HGF修复PMVEC中的作用：免疫荧光结果显示，LPS刺激PMVEC后导致Occludin表达减少，HGF可以增加Occludin的表达，STAT3抑制剂S3I-201逆转HGF的保护作用。内皮细胞旁和跨细胞通透性试验显示，HGF可以降低LPS损伤的PMVECs细胞旁及跨细胞通透性，这种保护性降低通透性作用被STAT3抑制剂S3I-201逆转并升高(P＜0.05)。ELISA试验显示，与LPS组相比，外源性给予HGF造成内皮损伤标志物ET-1及vWF减少，给予S3I-201后，内皮损伤标志物ET-1及vWF产生增多(P＜0.05)。WB信号通路检测显示，HGF较LPS组增加p-STAT3(Ser727)磷酸化水平;给予STAT3抑制剂S3I-201后，蛋白磷酸化水平降低。⑤mTOR/STAT3信号通路在HGF减轻PMVEC凋亡中的作用：LPS抑制PMVECs增殖活力，外源性重组HGF可以减轻LPS损伤的内皮细胞增殖活力(P＜0.05)；然而给予mTOR抑制剂雷帕霉素和STAT3抑制剂S3I-201阻断后，增殖作用被明显抑制(P＜0.05)。
应用AnnexinV-FITC法检测内皮细胞凋亡，结果显示，LPS明显增加PMVECs凋亡，HGF可以减轻LPS诱导的内皮细胞凋亡(P＜0.05)；给予mTOR抑制剂雷帕霉素和STAT3抑制剂S3I-201阻断后，HGF的抗凋亡的作用明显被抑制(P＜0.05)。
结论①MSC旁分泌HGF降低肺微血管内皮细胞旁和跨血管内皮细胞通透性，增加内皮细胞间接蛋白Occludin的表达，减少内皮细胞损伤标志物ET-1及vWF的表达，促进内皮细胞增殖，减少内皮细胞凋亡。②MSC旁分泌HGF通过激活mTOR/STAT3信号通路促进LPS损伤的肺微血管内皮细胞的修复。
第二部分mTORC1及mTORC2信号通路在MSC旁分泌HGF改善肺微血管内皮细胞损伤中的作用
目的研究mTORC1及mTORC2信号通路在MSC旁分泌HGF改善LPS诱导的PMVEC损伤中的作用。
方法采用Transwell小室构建MSC和PMVEC共培养体系，培养4-72h。PMVEC内加入脂多糖(LPS，100ng/ml)构建LPS诱导的损伤内皮细胞，PMVEC中加入外源性重组小鼠HGF(20ng/ml)，并构建基因干扰慢病毒介导的低表达mTORC1(Raptor)及mTORC2(Rictor)的PMVEC(PMVEC-shRaptor、PMVEC-shRictor)，检测mTORC1及mTORC2信号通路在MSC旁分泌HGF改善PMVEC损伤中的作用。同时给予AktAZD5363(1μM)检测Akt的作用。检测以下指标：①内皮细胞通透性：分别采用FITC-葡聚糖法和FITC-白蛋白法检测PMVECs细胞旁及跨内皮细胞通透性系数；②内皮细胞连接蛋白表达：采用流式检测内皮细胞连接蛋白VE-cadherin表达；③内皮细胞凋亡及增殖检测：分别采用AnnexinV-PE/7-AAD法和CCK8法检测内皮细胞凋亡及增殖；④相关信号通路检测：采用Westernblot检测p-Akt(Ser473)、Akt、Raptor、Rictor、p-mTOR(Ser2448)、mTOR蛋白表达。
结果①MSC旁分泌HGF对内皮细胞粘附连接蛋白VE-cadherin的影响：流式结果显示，与对照组比较，MSC-PMVEC共培养组及重组HGF组可以提高PMVECs的VE-cadherin表达(P＜0.05)；在信号通路的相关研究中，随着重组HGF作用时间的延长(4h-24h),mTOR、mTORC1(raptor)、mTORC2(rictor)表达逐渐增多，呈时间依赖性。②慢病毒介导的mTORC1(raptor)及mTORC2(rictor)低表达的PMVECs鉴定：采用基因干扰慢病毒介导，分别构建mTORC1(raptor)及mTORC2(rictor)低表达的PMVECs细胞株，荧光显微镜检测转染效率显示，细胞表达良好的绿色荧光信号。与干扰对照组PMVEC-GFP比较，PCR结果显示PMVEC-ShRaptor、PMVEC-ShRictor的RaptormRNA和RictormRNA表达水平明显降低(P＜0.05)。WB结果显示PMVEC-ShRaptor、PMVEC-ShRictor的Raptor蛋白和Rictor蛋白表达降低。③mTORC1(raptor)及mTORC2(rictor)对内皮细胞粘附连接蛋白VE-cadherin的影响：流式结果显示，与LPS组相比，给予外源性HGF后，内皮细胞粘附连接蛋白VE-cadherin的表达水平增高；分别给予shRaptor及shRictor下调PMVECs中raptor及rictor表达后，VE-cadherin的表达水平明显减少(P＜0.05)。④mTORC1(raptor)及mTORC2(rictor)对内皮细胞屏障的影响：流式细胞学分析显示，在给予重组HGF作用下，PMVEC-shRaptor及PMVEC-shRictor组分别较PMVEC-shRaptor-control及PMVEC-shRictor-control组相比，内皮的细胞旁及跨细胞通透性升高(P＜0.05)。WB结果显示，HGF可以提高LPS损伤的raptor及磷酸化的p-p70S6K(Thr389)蛋白，同时也提高LPS损伤的rictor及磷酸化的p-AKT(Ser473)蛋白表达；分别基因沉默mTORC1(raptor)及mTORC2(rictor)后，raptor、rictor及磷酸化的p-p70S6K(Thr389)、p-AKT(Ser473)蛋白水平降低。⑤mTORC2/Akt对内皮细胞屏障的影响：流式细胞学结果显示，阻断Rictor后，HGF刺激的VE-cadherin的减少，继续给予Akt的抑制剂AZD5363(1μM)后，VE-cadherin的表达减少(P＜0.05)。细胞通透性试验显示，与LPS+HGF共刺激组相比，shRictor(+)可以上调内皮细胞旁及跨内皮细胞通透性(P＜0.05)，Akt的抑制剂AZD5363可以继续上调内皮细胞旁及跨内皮细胞通透性(P＜0.05)。⑥mTORC1(raptor)及mTORC2(rictor)对内皮细胞凋亡的影响：细胞凋亡和增殖试验显示：外源性重组HGF可以减轻LPS损伤的内皮细胞凋亡、促进内皮细胞增殖(P＜0.05)；然而，基因沉默shRaptor及shRictor后，内皮细胞增殖作用被明显抑制、凋亡增加(P＜0.05)。凋亡蛋白Caspase-3的WB试验显示，与LPS+HGF共刺激组相比，基因沉默shRaptor及shRictor可以增加凋亡相关蛋白Cleaved-Caspase-3的表达。
结论①mTORC1及mTORC2信号通路的激活参与MSC旁分泌HGF修复LPS诱导的PMVEC损伤。②mTORC2/Akt参与MSC旁分泌HGF修复LPS诱导的PMVEC损伤。
第三部分mTOR/STAT3信号通路在HGF减轻LPS诱导的肺微血管内皮细胞线粒体依赖性凋亡中的作用
目的研究mTOR/STAT3信号通路在HGF减轻LPS诱导的PMVEC线粒体依赖性凋亡中的作用。
方法PMVEC内加入脂多糖(LPS，100ng/ml)构建LPS诱导的损伤内皮细胞，PMVEC中加入外源性重组小鼠HGF(20ng/ml)，同时加入mTOR抑制剂雷帕霉素(100nmol/L)或S3I-201抑制剂(100nm/L)检测mTOR/STAT3信号通路在HGF减轻LPS损伤的PMVEC线粒体依赖性凋亡中的作用。检测以下指标：①细胞内钙离子浓度检测：流式检测细胞内Fluo-4荧光变化；②活性氧(ROS)检测：流式DCFH-DA法检测ROS水平；③呼吸链复合物I(Complex I)表达：采用WB法检测ComplexI核心蛋白NDUFB8表达。④细胞凋亡及增殖检测：分别采用AnnexinV-FITC/PI法和CCK8法检测内皮细胞凋亡及增殖。⑤凋亡蛋白Caspase3蛋白检测：Westernblot法。⑥抗凋亡基因Bcl-2及Bcl-XLmRNA检测：逆转录-实时荧光定量聚合酶链式反应(Reverse transcription Real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)。⑦内皮连接蛋白VE-Cadherin和ZO-1检测：Westernblot法。
结果①mTOR/STAT3信号通路在HGF对内皮细胞内钙离子浓度的影响：Fluo-4荧光检测试验显示，与control相比，LPS刺激使内皮细胞内钙离子内流增加，HGF可以减少钙内流，给予mTOR抑制剂雷帕霉素及STAT3抑制剂S3I-201后，钙内流增加(P＜0.05)。②mTOR/STAT3信号通路在HGF对内皮细胞ROS的影响：流式DCFH-DA检测表明，随着HGF作用时间延长(30-60-90-120min),ROS的产生减少(P＜0.05)。同时，在30min的药物作用时间下，HGF可以减少LPS刺激产生的ROS产生；然而加入mTOR抑制剂雷帕霉素及STAT3抑制剂S3I-201后，ROS产生增多(P＜0.05)。③mTOR/STAT3信号通路在HGF对ComplexI的影响：WB结果显示，LPS可以造成ComplexI(NDUFB8)损伤，HGF可以减少LPS造成的ComplexI(NDUFB8)损伤；给予mTOR抑制剂雷帕霉素及STAT3抑制剂S3I-201后，ComplexI(NDUFB8)的表达减少(P＜0.05)。④HGF对LPS诱导的PMVEC凋亡及增殖的影响：流式AnnexinV-PE/7-AAD凋亡试验检测，随着HGF作用时间的延长(1h, 2h, 4h)，早期细胞凋亡比率降低；内皮细胞增殖试验显示，LPS可以降低内皮细胞吸光度(optical density，OD)值，给予HGF作用4h-12h-24h后，内皮细胞OD值增加(P＜0.05)。⑤mTOR/STAT3信号通路在内皮细胞凋亡蛋白中的影响：WB结果显示，LPS可以促进凋亡相关蛋白活性cleaved-caspase-3的增加，给予HGF可以减少cleaved-caspase-3的表达。mTOR抑制剂雷帕霉素及STAT3抑制剂S3I-201可以抑制凋亡蛋白的cleaved-caspase-3的表达(P＜0.05)。⑥HGF对抗凋亡基因Bcl-2mRNA及Bcl-XLmRNA的影响：RT-qPCR检测发现，与LPS组相比，HGF增加抗凋亡基因Bcl-2mRNA、Bcl-XLmRNA的表达，并且mTOR抑制剂雷帕霉素及STAT3抑制剂S3I-201可以抑制抗凋亡基因Bcl-2mRNA、Bcl-XLmRNA的表达(P＜0.05)。基因沉默mTORC1(raptor)及mTORC2(rictor)后，可抑制抗凋亡基因Bcl-2mRNA及Bcl-XLmRNA的表达(P＜0.05)。⑦HGF对内皮细胞连接蛋白VE-cadherin及Occludin的影响：WB结果显示，HGF可以增加损伤的内皮细胞连接蛋白VE-cadherin及Occludin；然而，给予mTOR抑制剂雷帕霉素及STAT3抑制剂S3I-201后，VE-cadherin及Occludin的表达水平减少。
结论mTOR/STAT3信号通路激活参与HGF减轻LPS诱导的PMVEC线粒体依赖性凋亡。