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在过去的三十年中,研究发现了一类具有穿膜活性的多肽,称为细胞穿膜肽(Cell-penetrating peptides,CPPs)。细胞穿膜肽序列通常很短,由5-30个氨基酸组成,大致可以分为三大类,即阳离子穿膜肽、两亲性穿膜肽和疏水性穿膜肽。它们可以作为载体将药物有效地递送入胞,这些药物包括小分子抗癌药物(如阿霉素、喜树碱等)和生物大分子(如质粒、siRNA、蛋白质等)。与其他药物载体相比,细胞穿膜肽的特点是生物相容度好、可生物降解、毒性低、成本低以及递送效率高。细胞穿膜肽的入胞机制一直以来都是该研究领域的一个难题,目前认为主要入胞机制分为两种,即非能量依赖的直接跨膜转运和能量依赖的内吞作用,而大部分的细胞穿膜肽是通过内吞作用进入细胞的。研究过程中发现细胞穿膜肽的入胞机制非常复杂,原因是不同类型的细胞穿膜肽之间入胞机制存在差异,而且同一类型的细胞穿膜肽受多肽浓度、细胞类型等因素的影响,入胞机制也不相同,因此经常会产生一些相互矛盾的结论。细胞穿膜肽序列中通常含有大量阳离子氨基酸残基,使其自身带正电荷。基于该特点细胞穿膜肽通过静电吸附的方式结合在细胞膜表面,之后被细胞摄取,而具体的摄取过程目前仍然未知。硫酸乙酰肝素(Heparan sulfate,HS)是一种膜表面带负电荷的生物高聚物,由不同的硫酸化重复二糖单元组成,通过共价键连接在膜蛋白上形成硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(Heparan sulfate proteoglycan,HSPG)。HSPG参与调节肿瘤细胞的代谢、增殖和血管生成,同时也有大量研究表明细胞穿膜肽的摄取过程也与HSPG有关。细胞穿膜肽CyLoP-1最早是从响尾蛇胺中截短获得的一段序列,它由10个氨基酸组成,序列中富含阳离子氨基酸残基。与其他已知的细胞穿膜肽相比,其特点是在低浓度条件下细胞摄取效率较高,细胞毒性较低,更重要的是摄取过程存在细胞选择性,但是目前针对其细胞选择性的特点没有解释。本课题针对细胞穿膜肽CyLoP-1的入胞机制展开研究,结果发现CyLoP-1在硫酸乙酰肝素高表达的Hela和A549细胞系中摄取效率较高,而在硫酸乙酰肝素低表达的Jurkat细胞系中几乎没有摄取,说明CyLoP-1的入胞过程与膜表面硫酸乙酰肝素有关,同时也解释了其细胞选择性的特点与该细胞系的硫酸乙酰肝素表达量有关。另外本课题也针对CyLoP-1进行了构效关系的研究,设计了一系列CyLoP-1类似物,通过细胞摄取实验筛选发现其中有两种类似物的穿膜活性显著提高,即CyLoP-M1和CyLoP-M4。对CyLoP-1及其类似物进行细胞毒性实验、乳酸脱氢酶释放实验和溶血活性实验评估其安全性,结果表明修饰后的类似物细胞毒性没有增加,保留了低毒的特点。体外等温滴定量热实验(Isothermal titration calorimetry,ITC)和动态光散射实验(Dynamic light scattering,DLS)结果发现与CyLoP-1相比,CyLoP-M1和CyLoP-M4的硫酸乙酰肝素亲合能力更强,并且引起硫酸乙酰肝素聚集的能力也更强。因此从入胞机制的角度提出了CyLoP-M1穿膜活性增强的合理解释,即在细胞摄取过程中,细胞穿膜肽和膜表面硫酸乙酰肝素的结合以及硫酸乙酰肝素的聚集有利于促进细胞内吞摄取。磷脂肽由于自身电负性的特点而无法穿过细胞膜,所以可以用于评估细胞穿膜肽的货物递送能力。实验结果表明在CyLoP-M1的N末端共价偶联磷脂肽之后,CyLoP-M1不仅可以有效地将磷脂肽递送入胞,而且比CyLoP-1的递送效率更高,因此CyLoP-M1具有成为新型细胞穿膜肽的潜能。