【摘 要】
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黄瓜（Cucumis sativus L.）是重要的蔬菜作物。AP1-FUL类MADS-box基因家族在植物生长发育过程中起重要的调控作用,Cs MADS21属于AP1-FUL类基因,其在黄瓜中的功能有待进一步确证。本研究以4种基因型黄瓜为材料,研究基因型、外植体类型、外源激素浓度、潮霉素浓度、特美汀浓度等对黄瓜遗传转化的影响,同时构建p CAMBIA1305-Cs MADS21RNAi载体,农杆
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黄瓜（Cucumis sativus L.）是重要的蔬菜作物。AP1-FUL类MADS-box基因家族在植物生长发育过程中起重要的调控作用,Cs MADS21属于AP1-FUL类基因,其在黄瓜中的功能有待进一步确证。本研究以4种基因型黄瓜为材料,研究基因型、外植体类型、外源激素浓度、潮霉素浓度、特美汀浓度等对黄瓜遗传转化的影响,同时构建p CAMBIA1305-Cs MADS21RNAi载体,农杆菌介导法转化黄瓜离体子叶节,经潮霉素筛选、分子检测和组织染色等获得阳性转化植株,对转化株进行表型观察分析。主要研究结果如下:1.p CAMBIA1305-Cs MADS21RNAi载体的构建。经比对分析,选取Cs MADS21基因200 bp保守序列,正反向插入到马铃薯GA20氧化酶基因的第一个内含子（199bp）中,构建599 bp干扰片段。经Bam H I-Xba I双酶切连接到p CAMBIA1305-GFP载体中,构建p CAMBIA1305-Cs MADS21RNAi载体。经Bam H I-Sac I酶切验证,得到约1400 bp（干扰片段+d35S启动子）的片段,说明p CAMBIA1305-Cs MADS21RNAi载体构建成功。2.黄瓜遗传转化体系研究。试验从基因型、外植体类型、苗态、外源激素浓度、潮霉素浓度、特美汀浓度等方面进行研究。结果发现,自交系2014-3的芽再生能力显著高于其它自交系。苗龄3 d左右,子叶直立且尚未展开的子叶节为最佳外植体。基因型不同,芽诱导的培养基也不同,其中自交系2014-3的最佳芽诱导培养基为2.0mg/L 6-BA+0.5 mg/L ABA+1.5 mg/L Ag NO3,再生芽率达到75%;自交系2014-5的最佳芽诱导培养基为1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L ABA+1.5 mg/L Ag NO3,再生芽率达到66.67%。芽诱导及根诱导阶段选用10 mg/L潮霉素进行选择培养,芽伸长阶段选用0.1 mg/L 6-BA进行培养,侵染后使用400 mg/L特美汀抑制农杆菌生长。3.p CAMBIA1305-Cs MADS21RNAi载体对黄瓜的遗传转化。利用冻融法将p CAMBIA1305-Cs MADS21RNAi转化农杆菌EHA105,将黄瓜子叶节置于OD600=0.7-0.8的农杆菌侵染液中侵染10 min,共培养2 d后,再置于最佳芽诱导培养基中培养。经10 mg/L潮霉素筛选,共获得抗性植株46株,其中自交系2014-2有11株,2014-3有9株,2014-4有4株,2014-5有22株。4.转基因植株的检测。利用潮霉素Hyg基因和GUS基因引物对抗性植株进行PCR扩增,同时对抗性植株不同器官进行GUS染色和GFP荧光检测。结果发现,部分抗性植株的PCR扩增获得预期条带;GUS染色结果发现,抗性植株雌蕊柱头呈现轻微蓝色,雄花花药呈深蓝色,而其他器官未出现蓝色。荧光检测发现,抗性植株的花粉囊内有清晰可见的绿色荧光,说明目的基因已成功转化黄瓜自交系,且自交系2014-2转化率0.35%,2014-3转化率0.98%,2014-4的转化率0.25%,2014-5转化率1.25%。5.转基因植株早代表型观察。试验对T0代植株表型进行观察分析。结果发现,T0代转化株出现主茎自然干枯现象,主茎高度、平均节间长度降低,分枝数增多,果实长度缩短。
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