多发性硬化症(Multiple sclerosis, MS)是目前临床最常见的一种中枢神经系统慢性脱髓鞘疾病,伴随着运动、感觉、认知功能障碍等临床症状反复发作和缓解。其病理改变为非特异性的中枢神经系统炎症、脱髓鞘和轴突丢失,并随着病程进展会形成中枢脱髓鞘斑块。多发性硬化症的主要临床症状有行走困难、疲劳、疼痛和记忆力下降等,这些症状的严重程度与中枢脱髓鞘病变的数量和炎症、脱髓鞘和轴突损伤、髓鞘再生修复和轴突修复的程度密切相关。在经典的复发-缓解型MS病人的自然病史中,其症状缓解期被认为是机体髓鞘再生修复和轴突功能代偿的关键时期,脱髓鞘的轴突会被新形成的髓鞘重新包裹,轴突功能失常也能逐渐恢复,所以多发性硬化症的缓解期也被认为是髓鞘再生修复期。但是,原发性进展型多发性硬化症(the primary progressive MS, PPMS)和继发性进展型多发性硬化症(the secondary progressive MS, SPMS)这两种特殊类型的多发性硬化症病人,他们的缓解期并不明显或根本不存在,PPMS和SPMS病人在第一次或第二次临床发病后,病程进展迅速,病情发展快,很快导致严重的功能障碍和身体残疾。PPMS和SPMS病人与经典的复发-缓解型MS病人最明显的区别,就发生在缓解期。为什么PPMS和SPMS病人病程进展这么快而且预后也不好?可能就是在缓解期发生了一些阻止髓鞘再生修复和轴突功能修复的事件。所以关注缓解期,特别是关注缓解期的髓鞘再生修复可能是解决问题的关键之所在。另一方面,脑组织具有一定的少突胶质细胞增殖分化和髓鞘再生修复的能力,但随着MS病程的进展,这种髓鞘再生修复是不完全的,甚至是失败的。所以经典的复发-缓解型MS虽然具有缓解期,且其破坏的髓鞘在缓解期也能得到一定程度的再生修复,但是这种髓鞘再生修复随着病程的发展是不能完全被补偿的,所以,随着病变积累,最终会导致严重的功能障碍和身体残疾。目前,对MS的主要治疗策略集中在抗免疫治疗或称之为免疫调节治疗方面,虽然能够有效的缓解MS复发的频率,但在对髓鞘再生修复、神经保护及功能残疾发展方面并没有太大的作用。综上所述,关注髓鞘再生修复的关键时期也就是MS的缓解期显得尤为重要。如果在这个关键时期能够保持足够数量和有功能的髓鞘,或促进其再生修复,进而有效的促进神经功能保护,对MS的治疗就会事半功倍。临床研究报道,PPMS和SPMS与经典的复发-缓解型MS在甲状腺激素(Thyroid hormone TH)水平上明显不同：在MS病人的脑脊液中,甲状腺激素水平明显异常,其中TT4水平明显升高,TT4/rT3比例升高；另外,脑脊液中rT3水平、TT4/rT3比例与MS的类型也有关系。但是,甲状腺激素水平的变化到底是疾病的原因还是结果尚不清楚。相关的MS临床案例提示我们,甲状腺激素可能在决定MS病人的临床类型和进程预后方面发挥重要作用,最可能的是,甲状腺激素通过影响髓鞘再生修复过程来影响MS病人的缓解期,导致临床症状发展的不同。大量研究表明,甲状腺激素是神经系统发育不可缺少的激素之一,它参与神经发育和髓鞘形成的关键过程,婴儿期和青春期缺乏TH会导致呆小症(以智力障碍和身材矮小为主要临床表现)。动物实验证实,在甲状腺机能减退动物模型中,髓鞘形成延迟；在甲状腺机能亢进动物模型中,髓鞘形成增加。甲状腺激素是干细胞分化和转分化、少突胶质细胞分化成熟、细胞停止分裂、终末髓鞘产生等过程中重要的影响和诱导因素。在急、慢性脱髓鞘动物模型中,给予外源性的甲状腺激素(T3)能够促进症状的缓解和髓鞘再生修复。但在脱髓鞘模型中,甲状腺激素的不足是否会对髓鞘再生修复产生影响,甲状腺激素在髓鞘再生修复期间的重要性如何?特别是在MS的缓解期----这个髓鞘再生修复的关键时期,甲状腺激素是否发挥独特的作用?此时额外给予适量的外源性甲状腺激素是否有利于促进机体的髓鞘再生修复和症状的缓解以及疾病的恢复?其具体机制是什么?目前并没有关于这些问题的实验研究。Cuprizone(CPZ)是一种选择性铜离子螯合剂,具有特异性诱导少突胶质细胞死亡作用,最终导致髓鞘损伤。CPZ诱导脱髓鞘动物模型是一个被广泛用来研究脱髓鞘和髓鞘再生修复的经典模型。我们应用CPZ诱导脱髓鞘,然后通过撤除药物模拟MS疾病的缓解期,观察此时的髓鞘再生修复情况,简述如下：CPZ诱导小鼠脱髓鞘模型通过喂食含0.2%CPZ的饲料6周而建立,可诱导明显的中枢神经系统脱髓鞘病变,然后,改为喂食正常饲料,让小鼠白行恢复2周,使髓鞘逐渐再生修复,模拟MS病人的缓解期。在髓鞘再生修复的2周,干预小鼠的甲状腺激素水平,通过给予含0.15%PTU的饮用水,以抑制小鼠自身的甲状腺激素分泌；同时,另一组给予腹腔注射外源性T3,以提高小鼠血清中的甲状腺激素水平。在此基础上,利用免疫组化、免疫荧光、电镜、行为学、Western Blotting等技术方法,观察甲状腺激素对中枢神经系统胼胝体区域的髓鞘再生修复和轴突保护的影响,并初步探讨其细胞机制。主要的研究结果分为以下三部分：第一部分：甲状腺激素对髓鞘再生修复期间小鼠体重及运动能力的影响。1.实验动物分组和甲状腺激素检测CPZ诱导脱髓鞘小鼠被分成4组,在诱导髓鞘再生的2周内,CPZ+PTU组给予含PTU饮用水抑制甲状腺激素,CPZ+N组给予正常饮用水作为对照；CPZ+T3组给予腹腔注射T3提高甲状腺激素,CPZ+PBS腹腔注射PBS作为对照。同时设置4组正常小鼠作为CPZ诱导脱髓鞘4组的对照,N+PTU组给予含PTU饮用水抑制甲状腺激素,N组给予正常饮用水作为对照；N+T3组给予腹腔注射T3提高甲状腺激素,N+PBS腹腔注射PBS作为对照。在第6周末,利用LFB+MBP染色鉴定脱髓鞘模型的可靠性,发现CPZ诱导脱髓鞘导致小鼠胼胝体区域大量脱髓鞘改变,证实了脱髓鞘模型建立成功。第8周末,为了验证小鼠甲状腺激素水平的改变,用放射免疫法检测了小鼠血清总T3和血清总T4水平,发现PTU能明显抑制小鼠血清总T3/T4的水平,而腹腔注射T3能够明显提高小鼠血清T3水平,反馈性抑制小鼠血清T4水平。证实了本实验利用PTU和T3成功的干预了小鼠在髓鞘再生期的甲状腺激素水平。2.小鼠体重监测作为总体情况的监测,每天称重小鼠的体重改变作为最基础和总体性的观察。正常小鼠体重缓慢增加,在第8周体重增加了8.053±1.22g,而CPZ诱导脱髓鞘导致小鼠体重急剧下降,在前2周体重丢失4.175±0.99g,在后面4周有缓慢的恢复并趋于稳定,在第6周末体重丢失1.495±1.24g。而撤除CPZ诱导髓鞘再生修复时,同CPZ+N对照组比较,CPZ+PTU组小鼠体重明显受到了抑制,其平均相对体重最后只能恢复0.38±1.70g (CPZ+N:3.59±1.14g) P<0.05。而CPZ+T3组的小鼠体重同CPZ+PBS组比较并没有明显的恢复,但是同CPZ+PTU组相比却有明显的恢复,其平均相对体重最后恢复2.14±1.09g P<0.05。说明甲状腺激素对髓鞘再生修复期小鼠的总体情况具有显著的促进恢复作用。3.小鼠协调运动能力和平衡能力监测为了评价小鼠的运动协调能力和平衡能力在髓鞘再生修复过程中的变化,我们利用旋转棒实验来记录他们在高速旋转棒上的维持时间。当撤除CPZ饲料诱导髓鞘再生修复的时候,CPZ+N和CPZ+PBS两个对照组小鼠在旋转棒上的时间得到明显的恢复,其运动协调能力和平衡能力得到明显改善,但是CPZ+PTU组小鼠在旋转棒的表现却受到了明显抑制,其在棒上维持时间停留在84.88±10.96s (CPZ+N:105.67±20.72s) P<0.05。而CPZ+T3组小鼠在棒上维持时间却得到明显的提升,其运动协调能力和平衡能力的到改善,其棒上维持时间恢复到120.10±14.70s (CPZ+PBS:106.13±14.38s) P<0.05。表明甲状腺激素在髓鞘再生修复期间的不足,会明显延缓小鼠的协调运动能力和平衡能力恢复,而提高甲状腺激素水平,能够促进其协调运动能力和平衡能力的明显恢复。4.小鼠自发活动和探索习性检测为了进一步评价小鼠在新环境中的自发活动强度和探索习性,旷场实验被用来检测小鼠在髓鞘再生修复2周后的旷场行为学表现。跟CPZ+N对照组小鼠相比,CPZ+PTU组小鼠在旷场中明显的自发活动和探索活动减少,其运动总路程只有15803.98±1241.49mm (CPZ+N:20396.96±2047.39mm) P<0.05。而CPZ+T3组小鼠在旷场中的自发活动和探索活动有轻微的提升,其运动总路程也达到了21167.86±1646.75mm (CPZ+PBS:19747.35±1682.11mm) P>0.05。但是小鼠的运动习性等高级功能却没有受到影响,各组的中间区域运动路程比例和中间区域停留时间比例都维持在3.7%和2.4%左右。说明了小鼠自发活动强度的改变可能主要是运动能力变化而引起,而与高级功能改变可能关系不大。第二部分：甲状腺激素对胼胝体髓鞘再生修复及少突胶质谱系细胞的影响。1.甲状腺激素促进胼胝体髓鞘的再生修复甲状腺激素在髓鞘再生修复期间对小鼠体重和运动能力具有显著性的促进恢复作用,为了验证甲状腺激素的上述作用是否是由于其对髓鞘再生修复的促进效应,本文以胼胝体区髓鞘为研究对象,用LFB组化染色和MBP免疫组化染色,Western Blotting技术验证小鼠胼胝体区域髓鞘改变情况。发现同CPZ+N组相比较,CPZ+PTU组小鼠胼胝体髓鞘染色明显稀疏,浅淡,且MBP髓鞘蛋白表达量明显减少(P<0.01),而CPZ+T3组同CPZ+PBS组相比,其髓鞘染色明显增多和致密,MBP髓鞘蛋白表达量明显增加(P<0.01)。说明在髓鞘再生期间,甲状腺激素不足明显抑制胼胝体髓鞘再生修复,而提高甲状腺激素水平能明显促进胼胝体髓鞘的再生修复。2.甲状腺激素促进胼胝体有髓轴突的数量增多为了检测甲状腺激素对有髓轴突以及髓鞘厚度的影响,应用电镜技术检测了各组胼胝体区髓鞘的改变,发现相比较于CPZ+N对照组,CPZ+PTU组胼胝体区域,正常髓鞘的轴突数量明显减少(P<0.01),裸露的轴突占主要成分,其有髓轴突的髓鞘厚度并没变薄,而CPZ+T3组,胼胝体区,正常髓鞘包裹的轴突明显得到恢复,其裸露的轴突数量较CPZ+PBS对照组明显减少(P<0.01),同样有髓轴突的髓鞘厚度并没有增厚。说明在髓鞘再生修复过程中,甲状腺激素的干预并没有影响髓鞘的厚度,而是通过影响有髓轴突的数量来影响髓鞘的再生修复。3.甲状腺激素促进少突胶质谱系细胞增殖髓鞘再生修复的不同是否与中枢髓鞘形成细胞——少突胶质细胞的改变有关?为了进一步验证胼胝体区少突胶质细胞的改变,我们用免疫荧光技术检测各组胼胝体区少突胶质细胞各阶段的改变。结果显示CPZ+PTU组在髓鞘再生修复过程中甲状腺激素的不足,会明显影响少突胶质细胞的成熟阶段,成熟前阶段以及前体阶段,导致所有阶段的细胞数目明显减少,与CPZ+N组相比较,CPZ+PTU组前体阶段只有其21.3%细胞数,成熟前阶段只有其76.7%细胞数,成熟阶段只有其58.7%细胞数。而且在室管膜下区(SVZ)几乎没有前体细胞的增生。但是,提高甲状腺激素水平却能明显促进少突胶质谱系细胞的增生。其胼胝体区成熟、成熟前、前体三个阶段的细胞数得到了明显的促进和增生,特别是室管膜下区(SVZ)有大量的少突胶质前体细胞明显增生。说明,在髓鞘再生过程中,甲状腺激素的不足,会显著抑制少突胶质谱系细胞的增殖,从而减少髓鞘的恢复；而提高甲状腺激素的水平则能明显促进少突胶质谱系细胞的增殖,从而促进髓鞘的再生修复。第三部分：甲状腺激素对轴突、星形胶质细胞以及小胶质细胞的影响。1.甲状腺激素促进轴突的髓鞘包裹和生存为了检测在髓鞘再生过程中,甲状腺激素对轴突的影响,我们利用激光共聚焦技术和电镜技术做了深入的观察。发现相比较于CPZ+N对照组,CPZ+PTU组小鼠胼胝体区域发现大量NF200阳性染色多而MBP阳性染色少的并存区域,红色的NF200染色区域表现为连续的,长线状的并沿轴突走行方向延伸。这些结果提示胼胝体区域大量裸露的轴突存在。而CPZ+T3组相比较于CPZ+PBS组则胼胝体区域表现为大量MBP阳性染色增多而NF200阳性染色减少的区域,并且NF200红色染色不再表现为连续而长线状的染色,提示甲状腺激素能够明显促进髓鞘重新包裹裸露的轴突。同时,电镜发现CPZ+PTU组的轴突线粒体明显增大,其直径几乎是CPZ+N组的2倍,而且轴突形态较大,提示轴突的生存状态恶化。而CPZ+T3组的轴突跟CPZ+PBS组一样都已经回归正常的水平,处在改善的状态。说明,在髓鞘再生修复的过程中,甲状腺激素能够促进髓鞘重新包裹轴突,进而改善轴突的生存状态,促进生存,改善其功能；而甲状腺激素的不足,明显抑制髓鞘重新包裹轴突,导致轴突的线粒体肿大,生存状态恶化,影响其功能。2.甲状腺激素减少星形胶质细胞增生而对小胶质细胞并没有明显影响在髓鞘再生修复过程中,提高甲状腺激素的水平能够明显减少胼胝体区域星型胶质细胞的增生以及促进其激活形态转变成正常形态。而相反的,甲状腺激素的不足,导致了胼胝体脱髓鞘区域大量星形胶质细胞增生,其细胞形态也为激活状形态。然而,甲状腺激素的改变对胼胝体区域的小胶质细胞的改变却没有明显的影响,小胶质细胞都在甲状腺激素不足组和甲状腺激素提高组都改变一致,没有显著性差异。说明甲状腺激素还可能通过影响星形胶质细胞的增殖和激活,影响髓鞘的再生。却对小胶质细胞的改变没有明显的影响。在临床上,MS病人发作期的预防治疗一直以来得到足够的重视,但是对MS病人缓解期的治疗却是关注不够。关注缓解期这一髓鞘再生的关键时期,维持和促进髓鞘再生应该是治疗MS的理想策略。我们的实验研究提示在多发性硬化症的缓解期这个重要的髓鞘再生过程中,机体的甲状腺激素扮演了一个非常重要的角色：甲状腺激素的不足通过减少少突胶质谱系细胞增殖分化和有髓轴突的数量、引起轴突的生存状态恶化以及星形胶质细胞的增殖和激活,导致髓鞘再生修复受阻、运动能力和体重恢复受阻；而提高甲状腺激素水平则能明显的逆转和促进上述的环节,但是甲状腺激素对髓鞘厚度以及小胶质细胞并不产生影响。本实验研究提供了甲状腺激素影响髓鞘再生修复过程的重要实验依据,并为以后多发性硬化症的治疗提出了关注MS缓解期的重要实验性证据。为多发性硬化症的治疗提供新的研究方向。