研究目的顺铂（cisplatin,DDP）是肺腺癌（lung adenocarcinoma,LUAD）两药联合化疗方案细胞毒作用的基础。然而,铂类耐药性的出现使许多患者不可避免地面临治疗失败。目前,成纤维细胞生长因子受体（fibroblast growth factor receptor,FGFR）被认为是有希望的LUAD治疗的靶点。因此,迫切需要鉴定FGFR抑制剂在LUAD中的作用及其机制,以期为DDP耐药的患者提供新的治疗药物。根据是否共价结合于胞内酪氨酸激酶结构域ATP 口袋中的P环半胱氨酸,FGFR抑制剂分为可逆和不可逆FGFR抑制剂。可逆FGFR抑制剂Erdafitinib和Pemigatinib已分别获得食品药品监督管理局（Food and Drug Administration,FDA）批准用于治疗转移性尿路上皮癌（metastatic urothelial carcinoma,mUC）和胆管癌。由于不可逆FGFR抑制剂具有更好的结合动力学和克服可逆FGFR抑制剂耐药的潜在能力,已成为更有前景的抗肿瘤药物。FIIN-2作为目前不可逆FGFR1-4抑制剂的代表性药物,可抑制包括肺鳞癌和大细胞癌在内的多种肿瘤细胞的增殖。然而,FIIN-2在LUAD中的疗效尚未得到系统性证实。自噬是细胞将受损、变性或衰老的蛋白质和细胞器运送至溶酶体进行降解的过程,在维持细胞代谢和内环境稳定等方面发挥重要作用。Beclin-1作为自噬的核心参与者,与B细胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/lewkmia-2,Bcl-2）和Vps34等不同分子结合形成磷脂酰肌醇3-激酶催化亚单位3型（phosphatidylinositol 3-kinase catalytic subunit type 3,PI3KC3）/Vps34-Beclin-1复合物,在自噬体的形成和成熟过程中发挥作用。自噬被诱导后,细胞质的微管相关蛋白 1 轻链 3（microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3）-Ⅰ 与膜表面的底物PE偶联形成膜结合的LC3-Ⅱ,即自噬体形成的标志。p62通过与自噬底物结合被自噬溶酶体降解。研究表明,自噬与肿瘤密切相关,具有抑制或促进肿瘤发展双重作用。自噬主要通过抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）或 Ⅲ 型磷脂酰肌醇 3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K）复合体激活而触发,FGFR下游PI3K/AKT是介导mTOR信号调控自噬的最经典途径。不可逆FGFR1-4抑制剂FIIN-2可通过阻断PI3K/AKT信号抑制包括肺癌在内的多种肿瘤细胞的生长,但FIIN-2的抗肿瘤作用是否与自噬有关目前尚无报道。在本研究中,我们利用具有代表性的人源LUAD A549及其DDP耐药的A549/DDP细胞系,探讨不可逆FGFR抑制剂FIIN-2的抗肿瘤作用,并阐述FIIN-2的抗LUAD作用与自噬的关系,以期为LUAD的治疗、特别是对DDP耐药的患者提供候选药物。研究方法1.使用苏木精-伊红（hematoxylin-eosin staining,H＆E）染色分析肺癌患者肿瘤组织的病理学类型。采用免疫组织化学技术（immunohistochemistry,IHC）分析FGFR2在LUAD患者组织中的表达情况。通过实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR,RT-qPCR）检测 A549 和 A549/DDP 细胞中FGFR1-4 信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid,mRNA）的表达情况。随后,采用Western blot检测两种细胞中FGFR2及其下游信号蛋白磷酸化成纤维细胞生长因子受体（phosphorylate fibroblast growth factor receptor,p-FGFR）、FGFR 底物 2（FGFR substrate 2,FRS2）和磷酸化 FGFR 底物 2（phosphorylate FGFR substrate 2,p-FRS2）的表达水平。2.采用细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8,CCK-8）法检测不同浓度DDP对A549和A549/DDP细胞活力的影响,计算DDP对两种细胞的IC50值及耐药指数（resistance index,RI）。并且通过 Western Blot 检测 A549 和 A549/DDP细胞中多药耐药蛋白1（multidrug resistance protein 1,MDR1）的表达。3.通过CCK-8法检测不同浓度FIIN-2处理对A549和A549/DDP细胞增殖的影响,并计算FIIN-2对A549和A549/DDP细胞的IC50值。4.采用流式细胞术（flow cytometry,FCM）和脱氧核苷酸末端转移酶介导的dUTP 缺口末端标记（Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling,TUNEL）荧光法评估 FIIN-2 对 A549 和 A549/DDP 细胞凋亡率的影响。通过JC-1染色检测线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential,MMP）的变化,并检测不同浓度的FIIN-2对线粒体凋亡途经的关键指标 Bcl-2、Bcl-2 相关 X 蛋白（Bcl-2-associated X protein,Bax）和凋亡效应蛋白cleaved Caspase-3的表达的影响。5.通过克隆形成实验检测FIIN-2对A549和A549/DDP细胞集落形成的影响。采用划痕法检测不同浓度的FIIN-2处理对A549和A549/DDP细胞迁移能力的影响,并通过Western Blot检测FIIN-2对A549和A549/DDP细胞迁移相关蛋白基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase-2,MMP2）、基质金属蛋白酶 9（matrix metalloproteinase-9,MMP9）表达的影响。6.利用Western Blot检测不同浓度FIIN-2对FGFR2及其下游p-FGFR、p-FRS2、p-AKT和p-ERK表达的影响,分析FIIN-2是否对FGFR2及其下游信号具有抑制作用。7.采用透射电子显微镜（transmission electron microscope,TEM）和单丹磺酰尸胺（monodansylcadaverine,MDC）法观察 FIIN-2 对 A549 和 A549/DDP 细胞自噬特性的影响。通过Western Blot检测FIIN-2对自噬相关蛋白（Parkin、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p62）表达的影响。8.通过Western Blot检测氯喹（Chloroquine,CQ）阻断自噬通量后FIIN-2对A549和A549/DDP细胞中自噬通量的影响。采用mRFP-GFP-LC3慢病毒载体感染A549和A549/DDP细胞,构建稳定表达mRFP-GFP-LC3的细胞系;通过激光共聚焦显微镜观察自噬体（黄色荧光）和自噬溶酶体（红色荧光）的数量,进一步验证FIIN-2对自噬通量的影响。9.为了研究FIIN-2是否通过抑制mTORC1信号发挥抗LUAD和诱导自噬作用,采用Western Blot检测FIIN-2对p-mTOR的影响;并用mTOR激活剂MHY1485单独或与FIIN-2联合处理细胞,CCK-8法检测细胞活力、Western Blot检测促凋亡蛋白Bax、cleaved Caspase-3和自噬标记物LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表达。采用AKT激活剂SC79或ERK激活剂LM22B-10单独或与FIIN-2联合处理细胞,Western Blot分别检测AKT/mTORC1信号蛋白（AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR）和 ERK/mTORC1 信号蛋白（ERK、p-ERK、mTOR、p-mTOR）的表达,探讨FIIN-2介导的mTORC1抑制是否与AKT和ERK信号有关。10.采用 Western Blot 检测 FIIN-2 对 Ⅲ 型 PI3K 复合体中 Vps34 和 Beclin-1 的影响,并且进一步采用免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation,Co-IP）检测FIIN-2对Beclin-1和Vps34的影响。通过FIIN-2联合或不联合mTOR激活剂MHY1485 处理细胞,Western Blot 检测 mTOR、p-mTOR、Beclin-1、Vps34和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的变化,鉴定FIIN-2是否通过抑制mTORC1进而激活Ⅲ型PI3K通路诱导自噬。11.采用Western Blot检测FIIN-2处理不同时间自噬与细胞凋亡相关蛋白的变化,阐明FIIN-2诱导的自噬与凋亡之间的关系。进一步,为了确定抑制自噬是否增强FIIN-2介导的细胞毒性,采用早期自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine,3-MA）或晚期自噬抑制剂CQ单独或与FIIN-2联合处理细胞,CCK-8法检测细胞活力,并且用Western Blot检测促凋亡蛋白cleaved Caspase-3、Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达情况。12.建立A549和A549/DDP细胞皮下异种移植瘤模型。两种模型裸鼠均分为四组分别用生理盐水、CQ、FIIN-2、CQ联合FIIN-2进行干预。小鼠处死后获取肿瘤组织,IHC分析增殖（Ki67）、凋亡（cleaved Caspase-3）和自噬（LC3）相关分子的表达情况;TUNEL法检测凋亡率;Western Blot检测凋亡（cleaved Caspase-3）、自噬（LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p62）标记物及 p-FRS2 信号通路。研究结果1.FGFR2在LUAD中高表达IHC结果显示,19例LUAD患者组织中均表达FGFR2,其中9例（47.37%）为FGFR2高表达。RT-qPCR检测结果发现,A549和A549/DDP细胞在mRNA水平均表达FGFR1-4,且FGFR2的mRNA水平相对较高。Western Blot结果显示,A549 与 A549/DDP 细胞均持续表达 FGFR2,且 FGFR2、p-FGFR 及 p-FRS2在A549/DDP细胞中的表达水平均高于A549细胞。2.A549/DDP相对A549亲本细胞的DDP耐药性鉴定CCK-8结果显示,DDP对A549/DDP细胞的细胞活力和IC50值明显高于A549细胞,分别为（122.01±28.52）μmol/L 和（7.76±3.39）μmol/L。A549/DDP 细胞相对于其亲本A549细胞对DDP的RI为15.7,并表现出相对较高的MDR1表达。3.FIIN-2抑制A549和A549/DDP细胞增殖并诱导线粒体介导的细胞凋亡CCK-8结果显示,FIIN-2剂量依赖性地降低A549和A549/DDP的细胞活力,并且FIIN-2对A549/DDP细胞的IC50值明显低于A549,分别为（16.3±0.4）μmol/L和（31.3±0.2）μmol/L。TUNEL染色和FCM评估细胞凋亡均显示,FIIN-2剂量依赖性诱导了 A549和A549/DDP的细胞凋亡。JC-1染色检测MMP发现,FIIN-2处理24h可使细胞中聚集体JC-1/单体JC-1的比例降低。Western Blot结果显示,FIIN-2剂量依赖性地降低抗凋亡蛋白Bcl-2的水平并增加促凋亡蛋白Bax和cleaved Caspase-3的表达,并且FIIN-2促进A549/DDP细胞凋亡的作用更为明显。4.FIIN-2抑制A549和A549/DDP细胞的集落形成和迁移能力结果显示,FIIN-2处理可以显著降低两种细胞的集落形成能力,并且在A549/DDP细胞中下降尤为显著。此外,FIIN-2处理24h或48h,A549和A549/DDP细胞的迁移能力均明显降低,并显著抑制A549和A549/DDP细胞迁移相关蛋白MMP2和MMP9的表达。5.FIIN-2抑制A549和A549/DDP细胞的FGFR2及其下游信号Western Blot结果显示,FIIN-2处理后,A549和A549/DDP细胞中FGFR依赖性信号蛋白p-FGFR、p-FRS2、p-AKT和p-ERK的表达均显著降低,且呈现剂量依赖性。此外,FIIN-2对A549/DDP细胞中p-AKT信号的抑制能力明显高于A549细胞。6.FIIN-2增加A549和A549/DDP细胞的自噬特性TEM 结果显示,用 10 μmol/L FIIN-2 处理 24h,A549 和 A549/DDP 细胞中自噬溶酶体的数量均明显增加。通过MDC法观察到,FIIN-2可以剂量依赖性地增加A549和A549/DDP细胞中酸性自噬囊泡的数量。Western Blot显示,FIIN-2增加了 Parkin的表达和LC3-II的积累,而p62的表达减少。并且上述现象在A549/DDP细胞中比在A549细胞中更明显。7.FIIN-2诱导A549和A549/DDP细胞的自噬通量我们用CQ阻断自噬溶酶体降解以确定FIIN-2对自噬通量的影响,结果发现FIIN-2联合CQ进一步增加了 FIIN-2诱导的LC3水平;同时,FIIN-2单药及其与CQ联合均降低了 p62的水平。进一步用FIIN-2处理稳定表达mRFP-GFP-LC3的A549和A549/DDP细胞系,结果显示,细胞中自噬体和自噬溶酶体的数量均明显增加。8.FIIN-2通过抑制AKT/ERK-mTORC1信号发挥抗LUAD和诱导自噬作用结果显示,FIIN-2抑制p-mTOR（ser2448）的表达,说明FIIN-2抑制了mTORC1的活性,并且对A549/DDP细胞的抑制能力明显高于A549细胞。mTOR激活剂MHY1485可以抵抗FIIN-2的抑制细胞活力及其诱导的凋亡和自噬作用。AKT激活剂SC79和ERK激活剂LM22B-10可分别抵抗FIIN-2对p-AKT和p-ERK的抑制作用,同时上调p-mTOR（ser2448）的表达。9.FIIN-2通过抑制mTORC1进而激活Ⅲ型PI3K通路诱导自噬结果显示,FIIN-2剂量依赖性上调Beclin-1和Vps34的表达,并且在A549/DDP细胞中上调尤为明显。进一步的Co-IP结果显示,FIIN-2促进了Beclin-1募集更多的Vps34。但是,mTOR激活剂MHY1485可以显著抵抗FIIN-2对p-mTOR（ser2448）的抑制作用,并降低了 Beclin-1、Vps34的表达和LC3-Ⅱ的积累。10.抑制自噬增强FIIN-2对A549和A549/DDP细胞的细胞毒性Western Blot 结果发现,FIIN-2 处理 A549、A549/DDP 细胞 6h 后可以使 LC3-Ⅱ的表达上调并在24h达到峰值,同时伴随着p62的下调;在A549细胞被处理12h、A549/DDP细胞被处理24h后,cleaved Caspase-3和Bax随着处理时间的延长而上调,同时伴随着Bcl-2的下调。另外,早期自噬抑制剂3-MA或晚期自噬抑制剂CQ单独使用都不会影响A549和A549/DDP细胞的活力。然而,FIIN-2联合3-MA或CQ均显著增加了 FIIN-2对细胞活力的抑制作用。更为重要的是,FIIN-2和3-MA/CQ共同处理也显著增加了促凋亡蛋白Bax和cleaved Caspase-3的表达。11.联合自噬抑制剂增强FIIN-2的体内抗LUAD作用体内实验发现,在A549和A549/DDP细胞裸鼠皮下移植瘤模型中,FIIN-2处理均可抑制肿瘤的生长,表现为肿瘤体积和重量明显减少,而FIIN-2联合CQ处理发挥更为明显的抑制肿瘤作用。IHC结果显示,FIIN-2可抑制Ki67的表达,且FIIN-2联合CQ抑制Ki67的效果更为明显。TUNEL染色显示,FIIN-2组细胞凋亡率明显增加,联合CQ组细胞凋亡率进一步升高,并伴有cleaved Caspase-3的上调。同时,联合CQ进一步增加了 FIIN-2对p-FRS2的抑制作用。另外,FIIN-2增加了 LC3水平并降低了 p62的丰度,并且联合CQ进一步增加了 LC3水平。结论1.不可逆FGFR抑制剂FIIN-2可通过抑制FRS2-AKT/ERK-mTORC1信号发挥抗LUAD作用,表现为可抑制A549和A549/DDP细胞的增殖、集落形成、迁移和诱导线粒体途径的细胞凋亡。2.FIIN-2可通过抑制mTORC1进而激活Ⅲ型PI3K复合体诱导A549和A549/DDP细胞发生促生存自噬。3.FIIN-2诱导细胞凋亡持续的时间比自噬长,从而可以克服保护性自噬的作用,导致LUAD细胞死亡。因此,联合自噬抑制剂在体内和体外均可以增强FIIN-2的细胞毒作用。4.FIIN-2对A549/DDP细胞的抗LUAD及诱导自噬作用明显高于A549细胞,这与其更明显地抑制A549/DDP细胞中AKT-mTORC1信号有关。