按照世界卫生组织制定的肿瘤分级系统来看,胶质母细胞瘤(GBM)是恶性程度最高的一种脑胶质瘤,它的特点是高度扩散,能侵入周围正常组织形成血管从而发生转移。恶性胶质瘤年发病率约为1/20,000,每年新发病例超过14,000例,以老年人发病最为常见[1]。胶质母细胞瘤细胞的迁移侵袭能力很强,而且病灶位于大脑,所以患者预后较差,当前的IV级胶质瘤患者的平均生存期为13个月左右,临床治疗难度很大[2],所以寻找新的分子标记物对于胶质母细胞瘤的治疗来说是极其重要的。泛素特异性蛋白酶38(USP38)是泛素特异性蛋白酶USPs家族中的一员,它包含半胱氨酸内肽酶活性和硫醇依赖性泛素酰水解酶活性。此前有报道称,USP38与原发性乳腺癌的发生有关[3];此外,USP38还在慢性阻塞性肺疾病的肺组织中表达上调[4];最近又有报道,USP38是一种LSD1特异的去泛素化酶,通过与LSD1相互作用从而影响细胞生理功能[5]。虽然USP38在原发性乳腺癌、慢性阻塞性肺疾病等疾病中已有相关报道,但是USP38在胶质母细胞瘤等恶性实体瘤中却基本没有相关的报道。本文我们通过Western Blot及R2数据库分析发现等,USP38高表达,GBM病人的预后差,生存期短。同时我们检测了不同胶质母细胞瘤细胞系及星型胶质细胞系SVGP12中USP38的表达量,结果显示USP38在GBM细胞系中显著高表达。接下来我们对USP38进行了敲低和过表达,希望通过功能性实验方法来探究USP38的低表达以及高表达对胶质母细胞瘤细胞的增殖、迁移侵袭和体内外的成瘤能力等相关生理功能的影响,并且在可能的情况下进行更深入的机制探究,以便为临床应用提供更多可靠的理论依据。以下是我们的实验结果:1.在胶质母细胞瘤中USP38的表达与病人的预后密切相关我们通过R2等数据平台分析发现,USP38表达量与胶质母细胞瘤的分级成正相关。我们利用RT-PCR和Western blot实验检测到USP38在胶质母细胞瘤细胞系中普遍表达,而星型胶质细胞中却极少表达USP38,这提示我们USP38表达量与胶质母细胞瘤的恶性程度成正相关的。2.USP38促进胶质母细胞瘤的增殖及成瘤为了探究USP38在胶质母细胞瘤细胞增殖及成瘤中的作用,我们利用慢病毒介导的shRNA干涉技术对于USP38进行了敲低。Western Blot实验显示,我们成功敲低了USP38。细胞的形态学观察显示,USP38干涉组胶质母细胞瘤细胞系的生长显著地被抑制。接下来,我们利用BrdU掺入实验对于细胞DNA合成进行了检测,结果显示,USP38干涉组的DNA合成受到了显著的抑制。随后我们用流式细胞术和Western Blot实验分别对细胞周期及细胞周期相关蛋白进行了检测,结果发现,USP38干涉后,细胞周期阻滞在G0/G1期,与之相关的周期蛋白如CDK2,CDK4等都发生了显著的下调。然后我们利用软琼脂克隆实验、小鼠皮下成瘤实验和免疫组织化学(IHC)实验对胶质母细胞瘤细胞体内外成瘤能力进行了检测,结果发现,当我们敲低USP38后,胶质母细胞瘤细胞体内外成瘤能力都显著降低。虽然我们设计了两条干涉片段,但是由于shRNA易发生脱靶效应,所以我们对于敲低USP38的细胞系进行了全片段长度USP38的恢复,确保相关生理功能的变化是由敲低USP38引起,并且检测USP38恢复后细胞的相关生理功能是否得到了恢复。实验证实,在USP38得到恢复后,细胞的相关生理功能得到了恢复。以上实验说明,泛素特异性蛋白酶USP38能够促进胶质母细胞瘤细胞的增殖及成瘤。3.USP38促进胶质母细胞瘤的迁移侵袭肿瘤细胞极强的转移能力是其难以治愈的一个很重要的原因。为了检测USP38对胶质母细胞瘤细胞转移能力的影响,我们将敲低USP38以及敲低USP38后再恢复USP38的不同胶质母细胞瘤细胞系进行了迁移侵袭检测能力的实验。结果显示,在敲低USP38后,细胞的迁移及侵袭能力都受到了显著的抑制并且间充质标志物Snail,MMP2等蛋白的表达在干涉USP38后都发生明显的下调。同样的,当我们恢复USP38后,胶质母细胞瘤的迁移侵袭能力得到了恢复,并且Snail,MMP2等蛋白的表达量也得到了一定程度的恢复。以上实验说明,泛素特异性蛋白酶USP38能够促进胶质母细胞瘤细胞的迁移侵袭。4.USP38抑制胶质母细胞瘤细胞凋亡为了探究敲低USP38对胶质母细胞瘤细胞系细胞凋亡的影响,我们对干涉USP38后的LN-229及U-87 MG细胞系进行了流式细胞和Western Blot实验。实验结果显示,USP38被敲低后,抗凋亡家族中的重要抗凋亡因子Bcl2等蛋白的表达量明显下降,细胞发生了明显的凋亡;而线粒体凋亡途径相关蛋白C-caspase3、C-caspase9、C-PARP等都显著上调,说明细胞凋亡可能是通过线粒体凋亡途径进行。接下来,我们对USP38进行了全片段长度恢复,流式细胞术和Western Blot检测,实验结果显示,胶质母细胞瘤细胞系的细胞凋亡得到了一定程度的恢复,并且Bcl2蛋白的表达量发生了上调,线粒体凋亡途径相关蛋白C-caspase3、C-caspase9、C-PARP等都发生了下调。以上实验说明,泛素特异性蛋白酶USP38能够抑制胶质母细胞瘤细胞的凋亡发生。5.USP38调控原癌基因c-Myc在胶质母细胞瘤中的表达原癌基因c-Myc在胶质母细胞瘤被证实为原癌基因。在USP38干涉后,我们通过RT-PCR及Western Blot实验发现c-Myc的m RNA水平和蛋白水平均发生显著下调。我们查阅GeneCards时,其预测c-Myc可能与USP38的启动子区域相结合,而我们查阅有关USP38的文献时发现其功能发挥基本上都是在蛋白水平。所以在考虑敲低USP38后它是如何下调c-Myc的表达量的这一问题上,我们首先没有从转录水平去考虑这一问题,而是从转录后的水平来考虑的。接下来我们做了IP实验,检测USP38与c-Myc是否有会有相互作用。实验结果显示,USP38与c-Myc是有结合的和相互作用的。但是究竟USP38是如何通过调节泛素化与去泛素化的平衡来调节c-Myc的表达量还需要深入研究其机制来解释。综上所述,USP38可能通过影响c-Myc的泛素化,在转录后水平调控c-Myc的表达,从而影响胶质母细胞瘤的增殖及迁移侵袭能力。本研究为USP38作为胶质母细胞瘤标记物提供了重要的依据,也丰富了胶质母细胞瘤分子治疗的理论基础。