转基因动物研究已经成为生命科学研究和开发的重要领域,也是发展新型畜牧业的有效途径之一。本研究旨在将嗜热菌糖苷酶(LacS)基因通过转基因手段整合到奶牛基因组,并通过构建乳腺特异表达载体使其在转基因个体的乳腺中表达,以期降低牛奶中乳糖比例。1.通过聚合酶链式反应(PCR)从pEGFP-Cl中得到启动子CMV并在其两端引入SacI和KpnI两个酶切位点,将其插入线性化载体pDsRed2-1红色荧光蛋白基因上游,指导该基因在真核生物中的表达,得到质粒pDsRed-CMV;将来自古细菌-硫矿硫化叶菌的β-乳糖糖苷酶基因(LacS)中的374个位点进行偏好性调整,用化学合成法获得优化后的LacS基因片段及以奶牛血液基因组为模板PCR得到的poly (A)加尾序列连入载体pDsRed-CMV的MCS中,得到载体pDsRed-CPL;最后,以奶牛血液基因组DNA为模板PCR扩增得到酪蛋白(BC)启动子片段,并在其两端引入XhoⅠ和SalⅠ两个酶切位点,将其插入线性化载体pDsRed-CPL的LacS基因的上游,得到质粒pBL,构建乳腺特异性表达载体。经酶切和PCR鉴定,质粒构建正确。2.采集牛胎儿皮肤组织,用组织块法分离培养牛胎儿皮肤成纤维细胞。对来源于经鉴定为雌性的牛胎儿的皮肤分离培养得到的原代成纤维细胞进行冷冻保存。共建立10个雌性牛胎儿皮肤成纤维细胞系,从中选择3个原代细胞游离快、形态良好且生长正常的皮肤成纤维细胞,测定生长曲线和核型分析。结果表明：选择的三个细胞系的F5代、F10代和F15代细胞生长均经历了潜伏期0-2天、对数生长期3-6天和平台期7天之后；三个细胞系F5代、F10代和F15代细胞染色体具有正常二倍体性的比率(正常染色体数目：2N=60)均在80%以上。说明这三个细胞系F15代之前均可作为核移植的供体细胞。3.经测序鉴定正确的质粒(DS-Red-LacS2),采用脂质体介导的转染方法转染已选择的3个牛胎儿成纤维细胞。转染18-24h后能够表达红色荧光的转染组合以1：30稀释培养,细胞生长汇合达50%-70%时,换为含600μg/ml G418的筛选培养液培养直至形成单克隆。将能够表达红色荧光的克隆混合扩大培养,并做目的基因检测。结果表明,能够表达红色荧光的混合克隆均能够检测到目的基因,因而筛选得到的混合克隆可以作为核移植的供体细胞。4.采用体细胞核移植法构建转LacS基因重构胚胎。经卵母细胞孤雌发育体系摸索,确定了转基因重构胚体外培养和发育的参数。结果表明,构建牛克隆胚胎过程中融合参数以电压100v、脉冲时间30μS和脉冲次数2次最佳,融合率达到78%-80%;激活采用离子酶素联合6-D的方法最佳,卵裂率达90%以上,囊胚率达30%以上。5.采用非手术法进行转LacS基因克隆胚胎移植。选择紧缩桑葚胚、早期囊胚和囊胚移植到同期发情的受体母牛子宫,60天妊娠检查结果,来源于2个不同细胞系作为核供体构建的重构胚移植后有受体牛妊娠,其中来源于Po6.17的细胞作为核供体的胚胎妊娠比例相对较高,且能够顺利产下新生小牛。采集新生牛颈静脉血液提取基因组,PCR进行目的基因检测,结果为阳性,初步确定新生小牛为转LacS基因克隆牛。