唾液酸酶的检测与唾液酸糖苷化反应的研究

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唾液酸酶是具有去除唾液酸基活性的糖蛋白,在生物体内许多重要的生理过程中发挥着不可或缺的作用。一般而言,唾液酸酶可以断裂糖缀合物末端与唾液酸残基相连接的糖苷键而水解唾液酸糖缀合物。本论文首先利用水溶性共轭聚合物发展了一种唾液酸酶的检测新方法;而后在此基础上发展了脂肪酶和β-半乳糖苷酶双酶检测体系;另外,还对唾液酸糖苷化反应的条件进行了系统研究。   1.通过调控阴离子共轭聚合物荧光的淬灭过程,实现了唾液酸酶的实时检测以及抑制剂筛选。荧光淬灭基团-NO2修饰的唾液酸酶底物PNP-Neu5Ac经过唾液酸酶水解后产生的PNP可以导致聚合物荧光淬灭。通过监测聚合物体系的荧光变化,在确定PNP-Neu5Ac浓度的前提下,通过改变唾液酸酶的浓度,实现了对唾液酸酶的实时检测。通过酶抑制实验测定了不同浓度抑制剂对唾液酸酶活性的抑制效应,为与流感病毒相关的唾液酸酶抑制剂筛选提供了一种新方法。   2.利用水溶性共轭聚合物的信号放大机理设计了一种脂肪酶和β-半乳糖苷酶的双酶检测体系。该体系包括四种元素:水溶性共轭聚合物、脂肪酶、β-半乳糖苷酶以及底物。底物中的硝基基团可以淬灭PFP-SO3-的荧光,经脂肪酶水解后淬灭基团远离聚合物使得其荧光恢复;随后经β-半乳糖苷酶继续水解后产生的PNP再次引起聚合物荧光的淬灭。以脂肪酶和β-半乳糖苷酶为输入信号,聚合物荧光的淬灭和恢复以及在450nm和416nm处荧光强度比值的变化为输出信号,可以进一步将该体系设计为四种不同的逻辑门,包括YES,INH,NAND和AND,方便地实现脂肪酶和β-半乳糖苷酶的连续高效检测。   3.以N-乙酰基-5-N,4-O-嗯唑烷酮保护的唾液酸对甲基苯硫苷为给体,不同种类的醇类化合物为受体,系统研究了促进剂体系Ph2SO/Tf2O/TTBPy的预活化时间、反应时间以及Ph2SO与TTBPy添加量对该糖苷化反应的影响。研究结果表明唾液酸糖苷化与Ph2SO和TTBPy的量有很大关系,Ph2SO(2.0-3.0 equiv)/TTBPy(0-1.0 equiv)可以得到更高α构型的唾液酸糖苷化产物。通过改变Ph2SO和TTBPy的量可以调控糖苷化反应产物的立体选择性,并提出了一种唾液酸糖苷化机理以解释该种调控作用。
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