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Toll样受体(TLRs)是一类保守的跨膜蛋白家族,是典型的用于检测入侵病原体的分子传感器。它们能够广泛的识别病原相关分子模式(PAMPs),如细菌和真菌的细胞壁成分、细菌脂蛋白、细菌和病毒的核酸;识别PAMPs后紧接着级联效应,促进炎症反应、激活先天性免疫和适应性免疫应答。大黄鱼(Pseudosciaenacrocea)是我国重要的海水经济养殖鱼种,本研究中,我们克隆和鉴定了大黄鱼内三个TLRs,Lyc TLR13,LycTLR7和LycTLR8,希望有助于加深对大黄鱼先天性免疫的认识,同时为大黄鱼病害防治提供新的思路。
Lyc TLR13,LycTLR7和LycTLR8的全长分别是2745 bp,3165 bp,3093 bp,依次编码914,1054,1030个氨基酸的蛋白。这三个蛋白具有典型的Toll样受体结构域:胞外段有数个富含亮氨酸的重复序列(Leucine-rich repeats,LRR),胞内段有一个保守的Toll/IL-1受体区域(Toll/IL-1 receptor domain,TIR)。值得注意的是LycTLR7胞外区比LycTLR8和LycTLR13多一个N-端LRR序列(LRR-NT)。此外,我们还在LycTLR7和LycTLR8胞外区域的氨基酸序列上发现了保守的CxRCxxxxxPCxxC结构域,该结构域是它们感受刺激并激活下游信号通路所必须的。亚细胞定位分析表明,这三个TLRs在鲤鱼上皮细胞(EPC)中都定位于内质网上,这结果与它们在哺乳动物中的同源蛋白相似。组织分布方面,它们在各种受试组织中都有表达,尤其在免疫相关组织中高表达,比如脾脏和肾脏。
受病毒类似物poly(I∶C)刺激后,LycTLR7和LycTLR8的在大黄鱼肾脏和脾脏组织中的表达水平都发生上调;细菌23S rRNA上的保守序列()ACGGAAAGACCCCG是小鼠TLR13的特异性配体,在受到它刺激后,LycTLR13在大黄鱼肾细胞中的表达水平发生上调。
值得一提的是,TLR13是一个知之甚少的Toll样受体家族成员,相关研究仅仅局限于小鼠TLR13。因此,我们使用了酵母双杂交系统、免疫共沉淀和双荧光素酶报告基因检测系统对大黄鱼TLR13的特性进行了研究。结果清楚的证明了大黄鱼TLR13能够直接的利用接头蛋白髓样分化因子88(MyD88),随后激活核因κB(NF-κB)信号通路,导致促炎细胞因子的产生。
以上结果表明:LycTLR13、LycTLR7和LycTLR8在大黄鱼免疫中可能发挥着重要的作用。