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目 的:慢性乙肝病毒感染现已成为全球性的健康问题。RNA 干扰技术是由 21～23nt 小双链 RNA 引发的转录后水平的基因沉默技术。本实验就是要在筛选出最佳转染效率的脂质体与质粒载体剂量配比的基础上,观察针对 HBV X 区设计的 siRNA 表达载体 pGenesil-HBV X 对 HepG2.2.15 细胞中HBV-DNA 复制和相应蛋白表达的影响。 方 法: (1)最适配比的筛选:在说明书建议范围内(2～7:1),进行阳离子脂质体 METAFECTENE 与质粒载体 pGenesil-EGFP 不同剂量配比的设计。转染 HepG2.2.15 细胞后 24 小时于荧光显微镜下观察不同配比的转染效率。用台盼蓝拒染法对各实验组细胞活性进行检测,在排除细胞毒性的基础上筛选出最佳转染效率的剂量配比。 (2)pGenesil-HBV X 转染 HepG2.2.15 细胞:将针对 HBV X 区设计的siRNA 表达载体 pGenesil-HBV X 同阳离子脂质体的最适配比复合物转染HepG2.2.15 细胞,分别于 24、48、72 小时检测上清液中 HBV-DNA 拷贝数及各种抗原标志物的表达。 (3)细胞培养上清液中 HBV-DNA 的检测: PCR 荧光定量技术。 (4)上清液中 HBsAg、HBeAg 的检测:采用时间分辨荧光免疫测定技术(TRFIA);无关蛋白 AFP 的检测:采用微粒子化学发光免疫分析法(MLFA)。 (5)细胞内 HBsAg 表达的检测:免疫细胞化学技术。 结 果: (1)在排除细胞毒性损伤的基础上,获得 50%以上转染效率的阳离子