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龙葵蛋白酶抑制剂Ⅱb基因(SaPIN2b)是龙葵蛋白酶抑制剂Ⅱ基因家族中的一员,编码一种丝氨酸型蛋白酶抑制剂。虽然,SaPIN2b与SaPIN2家族中的另外一员SaPIN2a在cDNA水平和推测的氨基酸水平上都有着相当高的同源性,但在表达模式上却大不相同。SaPIN2b在叶中受创伤诱导表达,而SaPIN2a除受诱导表达外,还组成型地在韧皮部中特异表达。
本研究中使用了5’cDNA末端快速扩增法(rapidamplificationof5’cDNAends,5RACE)来确定SaPIN2b的转录起始位点。测序结果表明,SaPIN2b的转录起始位点位于翻译起始密码子上游的第30个碱基处。
本研究发现,SaPIN2b启动子能驱使GUS(B-葡萄糖苷酸酶)报告基因在原核生物根癌农杆菌中表达。
为了研究SaPIN2b启动子在植物中的表达模式,本研究利用已构建好的双元载体PPsaPIN2b:GUS(1.42kbSaPIN2b启动子融合到GUS基因上游)分别转化龙葵、烟草和水稻,获得转基因植株,对GUS在转基因植物中的表达情况进行了分析。
GUS组织化学染色分析表明,SaPIN2b启动子能驱使报告基因在转基因龙葵和烟草的排水器(hydathodes)和腺体分泌型毛状体中特异表达,在植物的整个生长阶段都是如此。
为了寻找SaPIN2b启动子特异性表达的顺式作用元件,本研究对含6个不同的启动子5’序列缺失SaPIN2b:GUS融合基因的转基因烟草叶进行了GUS组织化学染色分析和GUS活性荧光分析。随着启动子序列缺失长度的增加,GUS基因的表达越来越低。当缺失进行到-332时便完全丧失了GUS活力。启动子的-617到-332这一区域为排水器和腺体分泌型毛状体特异性表达所必需,而腺体分泌型毛状体的腺细胞特异性元件则可能在-948到-617之间。