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侵袭与转移是恶性肿瘤的重要特征，是引起肿瘤病人死亡的主要原因。在肿瘤侵袭与转移过程中，需要多次侵袭基底膜，（1）：穿过基底膜进入基质；（2）：穿过内皮基底膜进入血道或淋巴道；（3）：到达远隔部位的肿瘤细胞穿过内皮基底膜进入基质，形成转移瘤。基底膜是以Ⅳ型胶原为骨架，由层粘连蛋白，纤维粘连蛋白，接触蛋白等组成的膜状结构。Ⅳ型胶原酶是降解Ⅳ型胶原的主要蛋白酶，它属于基质金属蛋白酶（MMP）家族，根据分子量可分为72kDa／MMP-2及92kDa／MMP-9两型，其编码基因具有部分同源性，均以原酶形式分泌于细胞外，需要Zn2+辅助激活。在不同组织类型的恶性肿瘤中，MMP-2及MMP-9均有不同程度的表达及活性增高，表明Ⅳ型胶原酶活性与肿瘤细胞的侵袭能力成正相关。研究证实胶原酶抑制剂能减少小鼠Lewis肺癌转移灶的形成，降低癌组织中血管内皮细胞的侵袭力与血管新形成。因此利用特异性抗Ⅳ型胶原酶抗体是阻断肿瘤侵袭与转移的新途径。为克服鼠源性单抗在抗肿瘤应用中存在的免疫源性高、分子量大、组织穿透力差等缺点，本研究在已建立的小鼠抗Ⅳ型胶原酶杂交瘤基础上，采用噬菌体抗体库技术构建、克隆表达抗MMP-9单链抗体。收集5x106个对数生长期抗Ⅳ型胶原酶92kDa小鼠杂交瘤M97细胞，提取mRNA，逆转录合成cDNA第一链，RT-PCR扩增出抗体重链可变区VH和轻链可变区VL。取纯化VH、VL，各50ng，加入1inker引物，以94℃变性50s，63℃退火并延伸1min，运行10循环组装成单链抗体基因scFv，再加入RS引物二次PCR，以在scFv基因5′、3′端加上Sfi Ⅰ及Not Ⅰ酶切位点。纯化的二次PCR产物经Sfi Ⅰ及Not Ⅰ酶切后插入噬菌体载体pCANTAB 5E，转化E coli. TG1感受态细胞，向对数生长期TG1转化细胞中加入3x1010 pfu M13K07辅助噬菌体援助重组噬菌体，建成重组噬菌体抗体库，涂板法测定库滴度为5x109pfu／ml.包被10ug／mlⅣ型胶原酶于细胞培养皿内，1％BSA封闭，加入重组噬菌体上清，对其进行一轮筛选与富集，随机选择再感染的TG1菌落扩增培养，并分别用M13K07辅助噬菌体再援救，取上清进行ELISA测定，选择对Ⅳ型胶原酶亲合力高的菌株提取质粒测定其基因序列，结果显示抗Ⅳ型胶原酶单链抗体基因(scFv-